Korte bespreking van verschillende unieke methoden voor holle vezels bij inclusie-BZ-zuivering

Inclusion Bodies (IB) zijn onoplosbare eiwitdeeltjes met een hoge dichtheid, gewikkeld in membranen die worden gevormd wanneer vreemde genen tot expressie worden gebracht in prokaryotische cellen, vooral in Escherichia coli. Wanneer het onder een microscoop wordt waargenomen, is IB een gebied met hoge breking, dat duidelijk verschilt van andere componenten in het cytoplasma.

De vorming van inclusielichamen is relatief complex, gerelateerd aan de snelheid van eiwitproductie in het cytoplasma, de concentratie van nieuw gegenereerde peptiden is hoog en er is niet genoeg tijd om te vouwen om amorfe eiwitaggregaten te vormen. De inclusielichaampjes zijn in principe samengesteld uit eiwitten, waarvan meer dan 50% gekloonde producten zijn. De primaire structuur van deze producten is volledig correct, maar de driedimensionale configuratie is verkeerd, dus er is geen biologische activiteit. De grootte van het insluitlichaam is 0,5-1μm, onoplosbaar in water, alleen oplosbaar in denatureermiddelen zoals ureum, guanidinehydrochloride, enz.

In E. coli kunnen inclusielichamen op twee locaties in de cel voorkomen: cytoplasma en perifeer cytoplasma. De locatie en kenmerken van inclusielichamen in de cel zijn afhankelijk van hoe eiwitten tot expressie worden gebracht.

De insluitsels in het cytoplasma van E. coli variëren doorgaans in diameter van {{0}}.2 tot 1,5 μm, en verschillende eiwitten hebben verschillende diameters, zoals de grootte van interferon is 0,811 μm, en de grootte van prostremsel is 1,281 μm. In sommige gevallen is de diameter van sommige insluitlichamen groter dan de diameter van E. coli, waardoor E. coli een uitsteeksel krijgt. Over het algemeen heeft een cel slechts één insluitlichaam.

 

Inclusie lichaamszuivering

 

Het zuiveringsproces van het insluitingslichaam is over het algemeen:

Cel verpletteren:

De algemene technologie van het verpletteren van cellen is: weefselvermaling met hoge snelheid, homogenisatie van glashomogenisator, ultrasone behandeling, herhaalde vries-dooimethode, chemische behandeling (meestal met behulp van lysozymbehandeling).

 

Inclusief lichaamswassing:

Inclusielichamen zijn inactieve vaste deeltjes die worden gevormd door intracellulaire agglutinatie van eiwitten die door bacteriën tot expressie worden gebracht en die gewoonlijk in amorfe, onoplosbare vorm voorkomen. In het insluitingslichaampje is het echte doeleiwit slechts verantwoordelijk voor ongeveer 50%, en de rest bevat lipiden, lipopolysachariden, nucleïnezuren en heteroproteïnen, die aan het insluitingslichaampje gebonden zijn en de renaturatie van het inclusielichaamseiwit beïnvloeden. Daarom is wassen vóór denaturatie een zeer noodzakelijke stap.

Bovendien is het wassen van inclusielichamen nuttig om de hervouwingsopbrengst van recombinante eiwitten te verhogen. Door onzuiverheden te verwijderen kunnen obstakels in het renaturatieproces worden verminderd, zodat het eiwit efficiënter kan worden gevouwen en op de juiste manier kan worden geassembleerd, waardoor de activiteit en functie van het eiwit‌ wordt verbeterd.

Bij het wassen werd gewoonlijk minder dan 1% van het neutrale wasmiddel gebruikt, zoals Tween, Triton, Urea en NP40 plus EDTA en reductiemiddelen 2-mercaptotreitol (DTT), -mercaptoethanol vele malen herhaald, omdat de wascapaciteit van het wasmiddel wordt vergroot met Om de ionsterkte van de oplossing te vergroten, kan bij het wassen van insluitlichamen NaCl worden toegevoegd om de ionsterkte te vergroten.

Insluitingslichamen kunnen worden gebruikt om andere componenten van de celafbraakoplossing te verwijderen door centrifugatie of filtratie, die beide profiteren van verschillende fysieke eigenschappen van insluitingslichamen.

 

Centrifugatie:

Inclusielichaameiwitten zijn veel dichter dan hetzelfde volume aan celfragmenten, dus het inclusielichaam kan door middel van centrifugatie van de rest van de cel worden gescheiden. Continue centrifugatie is de meest gebruikte bewerking voor het verkrijgen van insluitlichamen bij de industriële productie. Omdat de dichtheid van de celfragmenten kleiner is dan die van het insluitlichaam, is de sedimentatiesnelheid kleiner dan die van het insluitlichaam. Door continue suspensie en centrifugatie kan het grootste deel van het insluitingslichaampje worden gecentrifugeerd, terwijl de celfragmenten geleidelijk worden verwijderd.
Filtratie (tangentiële stroomfiltratie): Vanwege de verschillende moleculaire groottes van inclusielichamen en oplosbare eiwitten kan de filtratiemethode worden gebruikt, wat de bedrijfskosten kan verlagen en het gemakkelijk kan maken om op te schalen. Tangentiële stroomfiltratie (TFF) wordt aangedreven door het transmembraandrukverschil. Stoffen en onzuiverheden die kleiner zijn dan de poriegrootte van het membraan passeren het membraan, terwijl onzuiverheden zoals cellen met grotere deeltjes worden opgevangen. De membraanopening die doorgaans wordt gebruikt voor filtratiewassing is 0.1μm. Holle vezel tangentiële stroommicrofiltratie kan direct omgaan met een hoog vastestofgehalte aan vloeibaar materiaal, minder stappen, eenvoudige bediening, het membraan kan herhaaldelijk worden gebruikt door middel van reiniging, waardoor de investeringen in apparatuur en de bedrijfskosten worden verlaagd, in overeenstemming met de eisen van modulaire geautomatiseerde productie.

 

Het volgende is een toepassingsvoorbeeld voor het wassen van inclusielichamen met behulp van holle vezelkolommen van Guidling.

We gebruikten holle vezels van 94 cm2 0.1-0.45 μm om 250 ml vloeistof te concentreren (molecuulgewicht van het beoogde eiwit 17 kd). Tijdens het hele wasproces werd de terugwinningssnelheid van het doeleiwit en de uitputting van de membraanflux onderzocht.

0-71min is het concentratieproces, 71-224min is het was- en filtratieproces. Tijdens het hele microfiltratieproces nam de TMP geleidelijk toe, de vloeistofinlaatsnelheid bleef onveranderd en de gemiddelde materiaalstroom was 12LMH.

De resultaten toonden aan dat het doeleiwit volledig werd opgevangen en dat het terugwinningspercentage van het doeleiwit meer dan 90% bedroeg. Geleidingskolommen met holle vezels zijn stabiel en geschikt voor deze toepassing.

 

Ontbinding van het inclusielichaam:

Insluitingslichamen worden over het algemeen opgelost onder de voorwaarde van denaturatiemiddel ureum of guanidinehydrochloride, en de opgeloste insluitingslichaameiwitten worden volledig gedenatureerd, dat wil zeggen, behalve dat de primaire structuur en covalente bindingen behouden blijven, worden alle waterstofbruggen en hydrofobe bindingen vernietigd en hydrofoob zijketens zijn volledig zichtbaar.

Ureum en guanidinehydrochloride zijn denatureermiddelen van gemiddelde sterkte, die gemakkelijk kunnen worden verwijderd door dialyse en ultrafiltratie. De algemene concentratie van ureum 8-10M, guanidinehydrochloride 6-8M. Het oplossen van ureum heeft de voordelen van niet-ionisatie, neutraal, lage kosten, verwijdering van eiwit na renaturatie zal geen grote hoeveelheid eiwitprecipitatie veroorzaken, en opgeloste inclusielichamen kunnen worden gezuiverd door een verscheidenheid aan chromatografische methoden, dus het is op grote schaal gebruikt .

 

Inclusie lichaamseiwit hervouwing:

Het opgeloste recombinante eiwit moet correct worden gevouwen om een ​​functioneel eiwit te vormen. Technieken voor renaturatie omvatten verdunning van de eiwitoplossing tot vrijwel neutraal, verwijdering van denatureringsmiddel, renaturatie op kolom en gelfiltratiechromatografie. Onder hen is het verdunnen van de eiwitoplossing tot bijna neutraal en het verwijderen van denatureringsmiddel een gebruikelijke klassieke renaturatiemethode, vooral de verdunningsrenaturatiemethode heeft de hoogste bezettingsgraad.

Verwijdering van denaturant:

Dialyse: Het voordeel is dat het volume niet toeneemt en de verwijderingssnelheid van het denatureringsmiddel wordt geregeld door de concentratie van externe permeabele vloeistof geleidelijk te verlagen, maar het duurt lang en het is gemakkelijk om inactieve eiwitaggregaten te vormen, wat niet geschikt is voor grootschalige operatie en kan niet worden toegepast op productieschaal.

Ultrafiltratie (TFF): gemakkelijk om de dialysesnelheid te regelen, of het nu gaat om onderzoek en ontwikkeling, pilottest of productie, kan denaturanten (vloeistofverandering + concentratie) verwijderen door middel van ultrafiltratie (TFF).

 

Inclusie lichaamseiwitzuivering:

De methoden voor eiwitzuivering na renaturatie zijn vergelijkbaar met die voor oplosbare eiwitzuivering, namelijk ionenuitwisselingschromatografie, gelfiltratiechromatografie, affiniteitschromatografie, ammoniumsulfaat-uitzoutprecipitatie, enz.

Insluitingslichamen hebben geen biologische activiteit, er is geen reden om zich zorgen te maken over het verlies van eiwitactiviteit, en grote hoeveelheden expressie zullen niet leiden tot celdood en de weerstand tegen proteaseaanvallen maximaliseren. Jiuling holle vezels kunnen flexibel worden toegepast in het stroomafwaartse zuiveringsproces van insluitlichamen. Bij de wasstap van het insluitingslichaam kunnen uitstekende prestaties, vergeleken met centrifugaal wassen, het gebruik van holle microfiltratie-vezels met negen leeftijdstechnologie voor het wassen met tangentiële stroomfiltratie de procestijd aanzienlijk verkorten, en het algemene herstelpercentage kan meer dan 90% bereiken. Jiuling holle vezels kunnen ook worden gebruikt bij de eiwitrenaturatiestap van inclusielichamen. De troebelheid van de voedingsvloeistof die wordt gefilterd door holle vezels met microfiltratie zal aanzienlijk worden verminderd en de eiwitterugwinningssnelheid is hoog; Het gebruik van holle ultrafiltratievezels kan niet alleen denaturanten verwijderen, maar ook de laadtijd van het chromatografische monster verkorten, om tijd te besparen, het vulvolume te verminderen en de productiekosten te verlagen. Het herstelpercentage van microfiltratie/ultrafiltratie holle vezels varieert per materiaal, en het algemene herstelpercentage kan oplopen tot 90-95%.

Guidling Technology nodigt u uit om testkits aan te vragen voor gerelateerde beoordelingen.

 

Over Guidling

Guidling Technology is een nationale hightech onderneming die zich richt op biofarmaceutica, celcultuur, zuivering en concentratie van biogeneeskunde, diagnose en industriële vloeistoffen. We hebben met succes centrifugale filterapparaten, ultrafiltratie- en microfiltratiecassettes, virusfilters, TFF-systemen, dieptefilters, holle vezels, enz. ontwikkeld. Die volledig voldoen aan de toepassingsscenario's van biofarmaceutica, celcultuur, enzovoort. Onze membranen en membraanfilters worden veel toegepast bij het concentreren, extraheren en scheiden van voorfiltratie, microfiltratie, ultrafiltratie en nanofiltratie. Onze vele productlijnen, van kleine laboratoriumfiltratie voor eenmalig gebruik tot productiefiltratiesystemen, steriliteitstesten, fermentatie, celcultuur en meer, voldoen aan de behoeften van testen en productie. Guidling Technology kijkt ernaar uit om met u samen te werken!