Membraantechnologie en vaccinverduidelijking (Ⅰ)
Vaccins zijn afkomstig uit verschillende bronnen, waaronder weefselextracten, bacteriële cellen, virusdeeltjes, eiwitten en nucleïnezuren geproduceerd door recombinante zoogdiercellen, gistcellen en insectencellen.
De meest voorkomende methode voor vaccinproductie is gebaseerd op een eerste fermentatieproces gevolgd door zuivering. Vaccinproductie is een complex proces dat veel verschillende stappen en processen omvat. Het kiezen van de juiste zuiveringsmethode is cruciaal om de gewenste zuiverheid van het eindproduct te bereiken. Verduidelijking van vaccins is een belangrijke stap die een aanzienlijke impact heeft op productherstel en daaropvolgende zuivering. Verschillende technieken kunnen worden gebruikt om vaccins te verduidelijken. De keuze van de verzamelmethode en -apparatuur hangt af van het type batterij, de aard van het verzamelde product en de procesvloeistof. Deze technieken omvatten membraanfiltratie (microfiltratie, tangentiële stroomfiltratie), centrifugatie en diepe filtratie (normale stroomfiltratie). Uit een lange ervaring blijkt dat de klaring van vaccinoogst meestal wordt bereikt door centrifugatie gevolgd door diepe filtratie.
De laatste jaren hebben membraangebaseerde technieken aan populariteit gewonnen bij het verduidelijken van vaccins. Upstream-processen maken steeds vaker gebruik van wegwerptechnologieën, dus moeten oogststrategieën veranderen. Dit artikel biedt een uitgebreid overzicht van verschillende membraangebaseerde technologieën en hun toepassingen bij het verduidelijken van vaccins.
01 Inleiding
Vaccins zijn een cruciaal onderdeel van onze preventie van infectieziekten, die nog steeds een schokkende doodsoorzaak zijn. Tussen de 2 en 3 miljoen mensen worden elk jaar gered van difterie, tetanus, kinkhoest en mazelen dankzij immunisatie. Vaccins bestrijken een breed scala, van kleine recombinante eiwitten tot hele virusdeeltjes en hele bacteriën. Ze kunnen worden geproduceerd door verschillende systemen: eieren, zoogdiercellen, bacteriën, enz. Vanwege de complexiteit en diversiteit van vaccins is er momenteel geen gangbaar zuiveringsprotocol of sjabloon, ondanks de groeiende interesse in vaccinplatforms.
Normaal gesproken kan een vaccinproces worden onderverdeeld in drie delen: upstream (productie en klaring), downstream-behandeling (zuivering inclusief ultrafiltratie, chromatografie en chemische behandeling) en formulering (final-fill-bewerkingen). Onafhankelijk van het productiesysteem speelt klaring (de initiële verwijdering van ongewenste stoffen) een sleutelrol bij het bepalen van een robuust zuiveringsproces. Een goede klaringsstap verwijdert voornamelijk hele cellen, celresten, colloïden en grote aggregaten om de last van downstream-verwerking te verminderen. In sommige gevallen kan klaring ook onoplosbare onzuiverheden, gastheercelproteïnen (HCP) en gastheercelnucleïnezuren verminderen. Net als elke andere zuiveringsstap moet de klaringsstap worden geoptimaliseerd om maximale productopbrengst en zuiverheid te bereiken, terwijl deze wordt aangepast aan de specificiteit en productiebeperkingen van het vaccin.
Vanwege de heterogeniteit van de vaccintypen worden verschillende technieken gebruikt voor klaring, waaronder centrifugatie en filtratie (tabel 1).
Meestal zijn er meerdere reeksen bewerkingen nodig om de gewenste klaring te bereiken. De eerste bewerking is ontworpen om grotere deeltjes te verwijderen (primaire klaring) en de tweede bewerking is ontworpen om colloïden en andere submicrondeeltjes te verwijderen (secundaire klaring). Centrifugatie met lage snelheid dient als een eenmalige klaringsoptie, waardoor cellen en celresten door neerslag kunnen worden verwijderd. Centrifugatie kan hoge vaste ladingen aan en is veel gebruikt in batch- of continue modus en schijfcentrifuges. Het vereist hoge kapitaalinvesteringen en onderhoudskosten en kent uitdagingen bij het opschalen vanwege het ontbreken van een betrouwbaar schaalverkleiningsmodel. Sommige commerciële vaccinfabrikanten gebruiken centrifuges echter bij grootschalige productie met hoge verwerkingsvolumes en meer productieactiviteiten.
Clarificatiefiltratie kan worden uitgevoerd door normale stroomfiltratie (NFF, ook bekend als dead-endfiltratie) of tangentiële stroomfiltratie (TFF, ook bekend als cross-flowfiltratie). Er zijn ook specifieke filtermodi (diepe filters) die positief geladen materialen en filterhulpmiddelen bevatten die de retentie van celresten, colloïden en negatief geladen ongewenste componenten verbeteren.
Membraanfilters houden deeltjes vast door middel van size exclusion en hebben geen hoge vuilretentiecapaciteit, dus ze zijn geschikt voor secundaire klaringsstappen. Zowel diepe filters als membraanfilters zijn eenvoudig te schalen en te implementeren (eenvoudig systeemontwerp). In tegenstelling tot NFF wordt TFF voornamelijk gebruikt voor primaire klaring (microfiltratie). Membranen met een cut-offbereik van 0.1-0.65 μm (bij voorkeur met een open kanaal) zijn succesvol gebruikt om cellen, celresten en andere grote verontreinigingen vast te houden. De meeste TFF-apparatuur is lineair schaalbaar en herbruikbaar na reiniging, wat de kosten van verbruiksartikelen voor de stap aanzienlijk verlaagt.
De klaringsstap bevindt zich tussen de upstream- en downstreamprocessen en wordt soms over het hoofd gezien tijdens de ontwikkeling van het vaccinproces, omdat tijd en middelen prioriteit krijgen voor andere zuiveringsstappen, zoals chromatografie of dichtheidsgradiëntcentrifugatie.
Zelfs patenten voor vaccinproductieprocessen laten de klaringsstap vaak weg. De klaringsefficiëntie heeft direct invloed op de prestaties van het downstreamproces. Een slecht geoptimaliseerde klaringsstap kan de capaciteit van het gesteriliseerde filter negatief beïnvloeden of de levensduur van de chromatografische hars verkorten. Tegenwoordig zorgen strengere regelgevingsverwachtingen ervoor dat vaccinfabrikanten zuiverdere, goed gekarakteriseerde maar betaalbare vaccins produceren. In dit geval moet elke stap de aandacht krijgen die het verdient. Huidige trends suggereren dat het upstreamproces zich beweegt in de richting van een "schoner" expressiesysteem (d.w.z. cellen gekweekt in serumvrije media vervangen eieren) met een verhoogde productiviteit en hogere celdichtheid.
Downstream zuiveringsprocessen worden vereenvoudigd en gestroomlijnd om de zuiverheid van het eindproduct te vergroten. Om deze veranderingen aan te kunnen, mag de klaringsstap geen knelpunt worden. In dit geval voldoet filtratietechnologie aan een nieuwe klaringsuitdaging, waarbij de kwesties van verhoogde procesflexibiliteit, de mogelijkheid van eenmalig gebruik en lagere investeringskosten worden aangepakt.
02 Verduidelijking van virusvaccins
Verschillende soorten klaringsmethoden, afzonderlijk of in combinatie, zijn succesvol gebruikt om de oogst aan het begin van het vaccin te klaren.
Pilotschaal: 1-20L, productieschaal: meer dan 20L
2.1 Voorzorgsmaatregelen voor verduidelijking van het virusvaccin
Veel vaccins bevatten alle of een deel van de virusdeeltjes om immuniteit te vormen tegen virale infectie. Ze vallen over het algemeen in vier brede categorieën:
Levend verzwakt vaccin (LAV), dat is gebaseerd op een verzwakte stam van het virus om de virulentie ervan te verminderen. Verzwakte virussen kunnen zich in het lichaam vermenigvuldigen, maar zijn niet pathogeen.
- Geïnactiveerde virus (IV) vaccins, die chemisch of ultraviolet geïnactiveerde virussen bevatten om infectiviteit te elimineren. Virusdeeltjes kunnen compleet, verdeeld of gezuiverd zijn (alleen antigene eiwitten).
- Het virale vector (VV) vaccin is een actief, niet-pathogeen virus dat het antigeen van een pathogeen virus presenteert. Deze recent ontwikkelde structuren worden ook gebruikt voor gentherapietoepassingen.
VLP-vaccins (virusachtige deeltjes) zijn een specifieke klasse van virale subunitvaccins die de algemene structuur van virusdeeltjes nabootsen, maar geen infectieus genetisch materiaal bevatten.
In de meeste gevallen blijven de virusdeeltjes volledig intact tijdens de klaringsstap, zelfs tijdens de lysis van het virale vaccin (splitsing vindt meestal later plaats, in een meer gezuiverde omgeving).
De grootste uitdaging van virale klaring is het terugwinnen van hoogproductieve virale deeltjes terwijl celresten, grote aggregaten en onoplosbare verontreinigingen efficiënt worden verwijderd. Zoals beschreven in de volgende secties, zijn er verschillende factoren die virusdegradatie of -verlies kunnen veroorzaken. Bovendien kan het moeilijk zijn om op de virale opbrengst te vertrouwen vanwege de hoge variabiliteit van virale kwantitatieve testmethoden in deze fase van het proces, met name voor LAV- en VV-vaccins. Voor deze vaccins wordt de virale opbrengst vaak geëvalueerd met behulp van infectiviteitstesten zoals de plaquetest of TCID 50-test. Het feit dat sommige van de geoogste verbindingen de mogelijkheid van het virus om indicatieve cellen te infecteren kunnen verstoren, vergroot de variabiliteit van deze kwantitatieve benadering.
2.2 Strategie voor verduidelijking van virusvaccins
Virale vaccins variëren sterk in grootte, structuur, vorm en expressiesystemen (tabel 3).
Als gevolg hiervan is er over het algemeen geen template voor de downstream-processen, met name de klaringsstappen. In theorie kunnen alle beschikbare technieken (lage-snelheidscentrifugatie, microfiltratie TFF, NFF) worden geselecteerd en mogelijk gecombineerd om het virus te klaren. In feite wordt het succes van klaringsmethoden beïnvloed door het expressiesysteem en de fysisch-chemische eigenschappen van de betrokken virussen.
Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>{{0}} cellen /ml) klaringsmethode, met behulp van kationische polymeren, verminderde het diepe filtratiegebied met 4 keer vergeleken met traditionele methoden. Deze techniek maakt het mogelijk om fermentoren met een grote capaciteit te oogsten zonder het gebruik van centrifuges. Op vergelijkbare wijze toonden Riske et al. aan dat chitosanbehandeling van 40 L celculturen (0,02%) met 1,4-2,6% vaste stoffen leidde tot een 7-voudige toename van de absolute filtercapaciteit na diepe filtratie.
Ze vermelden ook dat chitosan de klaringsefficiëntie lijkt te verbeteren door submicrondeeltjes te flocculeren, die doorgaans in centrifuges bezinken. Voorbehandelings- en flocculatiemethoden zullen waarschijnlijk deel blijven uitmaken van toekomstige filtratieklaringen van vaccins. Penetranten, waaronder suikers, glycolen en aminozuren, flocculeren bij voorkeur virussen. Virale flocculatie met osmotische oplossing gevolgd door 0.2µ microfiltratie kan worden gebruikt als een uitgebreid proces voor viruszuivering. Penetranten kunnen virale aggregatie stimuleren door de hydratatielaag rond de deeltjes te verkleinen om hydrofobe niet-ingekapselde virusdeeltjes en ingekapselde virusdeeltjes te flocculeren. Hoewel is aangetoond dat penetranten virussen flocculeren, heeft de methode het potentieel om een platform te zijn voor toekomstige vaccinzuivering, en de haalbaarheid ervan in pilot- of grootschalige vaccinzuivering is niet bewezen. De flocculatievoorbehandelingsmethode, die waarschijnlijk deel zal blijven uitmaken van toekomstige filterklaring van vaccins, wordt uitgevoerd in een 2L-fermentor. Om potentieel te kunnen worden ingezet in grootschalige productieprocessen, moeten deze methoden worden gevalideerd op pilot- en productieschaal.
2.2.1 Systeemimpact uitdrukken
De klaringsmethode is voornamelijk afhankelijk van het type upstream-proces en expressiesysteem, dat het type en niveau van de te verwijderen verontreinigingen bepaalt. Virale vaccins worden meestal geproduceerd in kippenembryo's door continue cellijnen van zoogdieren of vogels of baculovirus-/insectencellen, die een complexer expressiesysteem vormen. Sommige typen VLP's kunnen ook worden geproduceerd door andere heterologe expressiesystemen (bacteriën, gist, plantencellen).
2.2.1.1 Virus geproduceerd in kippenembryo
Vaccins worden al tientallen jaren in eieren geproduceerd. Dit werk dateert uit 1931, toen Woodruff en Good Pasture met succes het chorio-allantoïsmembraan van vruchtbare eieren gebruikten als substraat voor virale groei. Tegenwoordig worden veel humane en veterinaire vaccins nog steeds geproduceerd met behulp van dit oude proces. Het bekendste is waarschijnlijk het seizoensgriepvaccin. Het principe is om kippeneieren te inoculeren met virussen van belang en vervolgens te repliceren in het chorio-allantoïsmembraan. Na de reproductie wordt allantoïsvocht dat rijk is aan virale deeltjes verzameld en gezuiverd.
Allantoïsvloeistof is een uitdagende klaringsvoeding. Het hoge mineraal- en eiwitgehalte (inclusief ovalbumine) zorgt voor een hoge viscositeit. Allantoïsvloeistof bevat ook essentiële weefselcomponenten van kippenembryo's, zoals veren, snavels, bloedvaten of bloedcellen. Vanwege het hoge vastestofgehalte is lagesnelheidscentrifugatie de voorkeursoptie voor primaire klaring, wat doorgaans resulteert in een herstelpercentage van ongeveer 70%. Primaire klaring met behulp van filtratietechnieken is echter ook mogelijk. Voor NFF hebben polypropyleen- en cellulosegebaseerde diepe filters goede allantoïsvloeistofopvangcapaciteiten. Oppervlaktefilters gemaakt van polypropyleen- of cellulosegebaseerde diepe filters kunnen een capaciteit hebben van 150-210 L/m² en de troebelheid van de toevoerstroom tot 3 keer verminderen. Het open toevoerkanaal TFF-apparaat is ook geschikt voor klaring van allantoïsvloeistof, omdat het apparaat geschikter is voor minimaal drukverlies door het toevoerkanaal, waardoor kanaalverstopping wordt verminderd.
De secundaire klaringsstap kan eenvoudig worden uitgevoerd met NFF. Een combinatie van polypropyleen, cellulose en glasvezelmaterialen vertoont over het algemeen een goede efficiëntie, en een alternatief voor de secundaire klaringsstap is om TFF en een {{0}}.65μm of 0,45μm microfiltratiemembraanapparaat te gebruiken en osmotische fluxcontrole te bedienen. Een open kanaal TFF-apparaat met een hydrofiele PVDF of een hydrofiele PES-membraan kan in deze stap worden gebruikt.
Het is belangrijk om op te merken dat virusdeeltjes geassocieerd kunnen worden met onoplosbaar puinmateriaal, wat de virale productie tijdens de klaring aanzienlijk kan verminderen. Het gebruik van een zoutoplossing kan deze associatie tussen influenzavirussen en vaste fragmenten verminderen, wat resulteert in een ongeveer tweevoudige toename in productie zonder de integriteit van de virusdeeltjes aan te tasten.
2.2.1.2 Virussen geproduceerd in opeenvolgende zoogdier- en vogelcellijnen
Onlangs zijn sommige virale vaccins afgestapt van op eieren gebaseerde processen ten gunste van op celkweek gebaseerde processen (met name voor influenzavaccins). De belangrijkste reden voor deze overstap is het voorkomen van problemen met de vaccinproductie die verband houden met embryonale eieren (d.w.z. een tekort aan eiervoorraad dat kan optreden in het geval van een uitbraak van een pluimveeziekte). Als gevolg hiervan worden veel soorten vaccins en virale vectoren momenteel ontwikkeld met behulp van continue cellijnen van zoogdieren of vogels, conventionele cellijnen (zoals Vero-, MDCK- of HEK293-cellijnen) of gepatenteerde cellijnen.
Afhankelijk van het expressiesysteem kan het virus in de cel blijven, wat een cellysestap vereist, of het kan buiten de cel blijven (lysis of budding). De vaste lading en oplosbare inhoud verkregen uit celkweek zijn veel schoner dan de allantoïsche vloeistoffase. Als gevolg hiervan is NFF-technologie gemakkelijker te implementeren en is de capaciteit aanzienlijk hoger. De filtratiecapaciteit is echter sterk afhankelijk van de celkweekomstandigheden, zoals celdichtheid of celviabiliteit bij oogst. Deze parameters beïnvloeden de hoeveelheid celresten en macroaggregaten die diepe filters en membranen kunnen verstoppen, wat resulteert in een verminderde capaciteit.
Thomassen et al. geven een goed voorbeeld van NFF-verduidelijking. Gebruikt in het productieproces van geïnactiveerd poliovirus (IPV). Vero-cellen gekweekt op microdragers werden gebruikt voor virale proliferatie met een celdichtheid van {{0}}.78 x 106 cellen /ml TOI. Een roestvrijstalen zeef van 75 μm wordt gebruikt voor pre-verduidelijking om microdragers uit de oogst te verwijderen. De dubbellaagse gradatie wordt verduidelijkt met behulp van een dichtheidsdiepfilter (0,2-2.0 μm), gevolgd door een gesteriliseerd gradatiefilter.
De geselecteerde schaalbare wegwerpeenheid werd succesvol gebruikt voor de voorbereiding van Sabin IPV klinisch proefmateriaal op 350 L schaal. Afhankelijk van het virusserotype wordt een virusherstelpercentage van 86 tot 96 procent verkregen.
2.2.1.3 Baculovirus/virusachtige deeltjes geproduceerd in het insectencelsysteem
De overweging van baculovirus/insectencelsystemen voor grootschalige vaccinproductie is relatief nieuw, maar trekt steeds meer interesse in het veld van virale vectoren en VLP's. Het belangrijkste voordeel van dit systeem is dat het een kortlevende (geen noodzaak om cellijnen op te zetten) en veilige (geen compleet viraal DNA) productie betreft. Er zijn ook enkele nadelen, zoals de noodzaak om baculovirus te verwijderen en de stabiliteit van het product.
Cervarix, een VLP-vaccin tegen infectie met humaan papillomavirus geproduceerd door GlaxoSmithKline, is het eerste humane vaccin dat commercieel wordt geproduceerd in insectencellen. Een aantal vaccins gebaseerd op VLP's en rAAV-vectoren geproduceerd in met baculovirus geïnfecteerde insectencellen zijn momenteel in ontwikkeling. Insectencellijnen afgeleid van herfstlegerworm Spodoptera frugiperda (Sf9 en Sf21) en koolbuikworm Trichoplusia ni (BTI-TN5B1-4 cellen) worden het meest gebruikt vanwege hun vermogen om in suspensie te groeien, wat de amplificatie van het stroomopwaartse proces vereenvoudigt. Na te zijn gegroeid tot de gewenste dichtheid van levende cellen, worden deze cellen geïnfecteerd met recombinant baculovirus in de exponentiële celgroeifase voor eiwitexpressie. Het grote genoom van baculovirussen maakt de expressie van vijf of meer verschillende eiwitten mogelijk, wat overeenkomt met de complexiteit van VLP en virale vectoren.
Bernard et al. beschreven het downstream-proces van insectencelcultuur. Het proces is zeer variabel, wat de diversiteit van eiwitten weerspiegelt die met deze techniek worden geproduceerd. De eerste stap van de zuiveringssequentie wordt sterk beïnvloed door de volumekarakteristieken van de bioreactor (d.w.z. celdichtheid en levensvatbaarheid), of door de aard van de productafgifte (afgescheiden door knopvorming of cellyse). Baculovirusinfectie van insectencellen kan binnen 3-5 dagen cellyse veroorzaken. De vernietiging van cellen kan leiden tot een toename van proteolytische activiteit en andere omgevingsfactoren die kunnen leiden tot de afbraak van recombinante eiwitten.
Er zijn pogingen gedaan om baculovirussen te ontwikkelen met een lager vermogen om cellyse te initiëren. Het baculovirus lyseert minder dan 10 procent van de geïnfecteerde insecten.
Cellyse kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende methoden, zoals vries-dooi, detergenten, homogenisatoren of ultrasone behandeling. Insectencellen hebben geen celwand en lossen daarom snel op. Hoewel ultrasone behandeling is gerapporteerd in veel bench-processen, wordt het zelden gebruikt op experimentele of commerciële schaal. De meest voorkomende methode is het gebruik van een homogenisator om cellen te vernietigen in aanwezigheid van een lage concentratie detergent (0.1% Triton X-100 of NP-40). Het gebruik van detergenten en microfluïdisatie of osmotische impacthomogenisatie zijn succesvol toegepast in veel grootschalige productieprocessen. Meestal worden insectencellen gesuspendeerd in lysisbuffers (50 mM TRIS pH7.7, 300 mM NaCl, 5% glycerol, 0.2 mM PMSF en proteaseremmers), waarbij Triton-X100 wordt toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie van 0.1%, gevolgd door milde ultrasone of microfluïdisatie. Het mengsel wordt vervolgens gecentrifugeerd om onoplosbare deeltjes te verwijderen.
In dit stadium kan het lysaat er erg troebel uitzien en is het moeilijk te filteren met een 0.45μm filter. Soms kunnen verliezen tot 30% worden waargenomen tijdens de pyrolyse-klaringsstap. De toevoeging van benzo-enzymen in de splitsingsfase helpt het filtratieprobleem op te lossen. Het reinigen van de cellen met fosfaatgebufferde pekel na de oogst en snelle "vries-dooi" in een hoog zout (500 mM NaCl) met de kraakbuffer helpt de aggregaten te verwijderen.
Verduidelijking van VLP's en virale vectoren geproduceerd door insectencellen vindt plaats na cellyse (door chemische of mechanische behandeling), waarbij niet alleen virale deeltjes vrijkomen, maar ook grote hoeveelheden cellulair nucleïnezuur. Insectencellen kunnen groeien met een hoge celdichtheid, van 1-9.10 6 cellen/ml. Daarom moet de verduidelijkingsstap omgaan met een hoge celdichtheid, een hoog nucleïnezuurgehalte en, indien mogelijk, verwijdering van baculovirusdeeltjes. Om het nog ingewikkelder te maken, kunnen VLP's of virale vectoren en baculovirussen vergelijkbare groottes hebben (baculovirussen zijn 60-80 nanometer breed en 300-400 nanometer lang). Vanwege de hoge celdichtheid is centrifugatie al tientallen jaren de voorkeurstechniek voor primaire verduidelijking. Membraanprocessen lijken echter een zeer aantrekkelijk alternatief omdat schaalbaarheid eenvoudig te definiëren is.
Diepe filters zijn effectief gebruikt in het downstream-proces van drielaags rotavirus-achtige deeltjes. Op laboratoriumniveau wordt de CsCl-dichtheidsgradiënt-ultracentrifugatiemethode vaak gebruikt om deze complexe deeltjes te zuiveren. De onderzoekers evalueerden niet alleen de klaringsstap van het diepe filter, maar ook het hele downstream-proces (Triton X-100-splitsing en diepe filtratie, gevolgd door ultrafiltratie en uitsluiting van deeltjesgrootte). De resultaten laten zien dat de opbrengst van de CsCl-dichtheidsgradiënt 37% kan bereiken.
De ultracentrifugale methode is ongeveer 10%. Als een ander voorbeeld werden 0,45 μm holle vezels en 500 kDa fijne diameter vezels gebruikt om HIV-achtige deeltjes geproduceerd in insectencellen te herstellen en te concentreren. In deze studie werd de schuifkracht van holle vezels geoptimaliseerd op basis van celintegriteit. Resultaten Een proces met lage schuifkracht werd vastgesteld om tafelsuikergradiënt-ultracentrifugatie te vervangen.
Het proces heeft het potentieel om te worden toegepast op massaproductie. Diepe filters zijn ook succesvol gebruikt bij de productie van recombinante adeno-geassocieerde virussen. Cellyse werd uitgevoerd met een mechanische celjammer met twee zuigers, gevolgd door nucleasebehandeling. In de klaringsstap werd een 1,2 μm glasvezel diep filterelement gebruikt, gevolgd door twee lagen van 0.8 μm hydrofiel PES en 0.2 μm hydrofiel PES. Proportioneel gedimensioneerde filters worden gebruikt voor procesbatches van kleiner tot 200 L-groottes. Diepe filters zijn succesvol gebruikt en TFF-classificaties met platte films of holle vezels van 0,2 µm of 0,45 µm zijn ook als zeer effectief gerapporteerd.
De studie van Tecnologica (IBET) aan het Oeiras Institute of Experimental Biology in Portugal gebruikte NFF om hepatitis C VLP uitgedrukt door baculovirussen te verduidelijken zonder centrifugatie. Nominaal beoordeelde polypropyleenfilters (10,5,0.6 en 0.3μm) filters worden gebruikt om VLP-oogst te verduidelijken. Dezelfde filters met 0.6μm en 0.3μm porieclassificaties worden gebruikt voor filtratie in VLP-oogstcentra. Alle bestudeerde filtraten werden getest op HCV-VLP-herstelpercentages en de aanbevolen filtratiemethoden werden vergeleken. De resultaten worden weergegeven in Tabel 4.
De resultaten toonden aan dat het 5μm-0.3μm filter de hoogste product recovery (100%) had voor direct geoogste hepatitis C VLP feed. Het polypropyleen 0.6μm filter had de hoogste product recovery (82%) voor de centrale feed, en de DNA-klaring van de gastheercel was ongeveer 70%.
2.2.1.4 Virusachtige deeltjes geproduceerd in bacteriële of gistsystemen
Het type klaringsmethode voor VLP-vaccins die tot expressie worden gebracht in bacteriële of gistsystemen, hangt af van de afgifte van VLP aan extracellulaire mediatoren. Als VLP's niet efficiënt kunnen worden afgescheiden, zijn cellyse of andere extractiestappen mogelijk vereist vóór de daadwerkelijke klaringsstap. Hoewel dit de gouden standaard is in de eiwitklaringsindustrie, centrifugatie (continu of batch) tot expressie gebracht in bacteriële of gistgebaseerde systemen, zijn membraanprocessen de laatste tijd een zeer aantrekkelijk alternatief geworden vanwege hun gemakkelijke schaalbaarheid en compatibiliteit met behandelingen voor eenmalig gebruik.
Richter en Topell leggen het gebruik van centrifugatie, TFF of een combinatie van beide uit bij het bereiden van VLP's die zijn geproduceerd in geklaarde E. coli. In hun werk werden 0.45m TFF-membranen gebruikt om de gehomogeniseerde E. coli-homogenaten te verdunnen en te klaren bij een temperatuur van 5 graden. Ze merken ook op dat op membranen gebaseerde TFF geschikt is voor het verwerken van oogsten met een hoge viscositeit, bij voorkeur met behulp van TFF-eenheden met open kanaalconfiguraties.
Centrifugale klaring is ook geëvalueerd als alternatief voor TFF. In dit geval werd het resulterende homogenaat niet verdund en gecentrifugeerd bij 4 graden gedurende 105 minuten, 10000g. Zonder de zachte coating over te brengen, werd de supernatant uit de deeltjes gegoten en opnieuw gecentrifugeerd bij 4 graden en 10.000 g gedurende 60 min. De supernatant werd vervolgens verwijderd uit de aanwezige deeltjes, verdund met EB-buffer (43,89 mM Tris HCl, 6,11 mM Tris Base, 5,0 mM EDTA, 10% (v/v) Triton X-100) 1:2, en gefilterd op een 0,22 m steriel filterapparaat. Verdere verwerking. Het opschalingsproces voor de productie van dit VLP-vaccin in E. coli op een schaal van 800 liter werd naar verluidt ook verduidelijkt door de combinatie van centrifugatie en TFF.
Het recombinante hepatitis E-vaccin HEV 239 is in China goedgekeurd voor het immuniseren van volwassenen van 16 jaar en ouder. Vaccinantigenen (VLP) worden tot expressie gebracht in E. coli en het opschalen van het antigeenproductieproces is aangetoond op een schaal van 50L. Het product werd geëxtraheerd door E. coli te kraken en de insluitlichamen werden gescheiden van de celfragmenten door zwaar wassen met een buffer die 2% Triton X-100 bevatte en vervolgens opgelost met een 4 M ureumhomogenisator. TFF verheldert humaan papillomavirus VLP geproduceerd in Saccharomyces cerevisiae (15L). Het cellysaat behandeld met nuclease werd verhelderd door crossflow-microfiltratie in transfiltratiemodus met behulp van een 0,65 μm hollevezelfilter. Hetzelfde proces wordt gebruikt bij de productie van vaccins. Hoewel slechts een handvol VLP-gebaseerde vaccins de commerciële schaal heeft bereikt, zijn er verschillende VLP-gebaseerde vaccins in ontwikkeling. De meeste hiervan worden opgehelderd met behulp van centrifugatie of membraantechnologie.
Beperkt door de invloed van de ruimte, zullen we de tweede helft van de inhoud in het volgende hoofdstuk delen. In het volgende artikel zullen we enkele gevallen van vaccinverduidelijking en het gebruik van relevante membraancomponenten delen.
Als eerste bedrijf in het lokalisatiecircuit heeft Guidling Technology voldoende relevante ervaring opgebouwd in vaccinverduidelijking. Guidling Technology is een ontwikkelings- en productiebedrijf dat zich richt op biofarmaceutica en celkweek, zuivering en scheiding. Producten worden veel gebruikt in biomedische, diagnostische, industriële vloeistoffiltratie-, detectie-, verduidelijkings-, zuiverings- en concentratieprocessen; Guidling heeft met succes ultrafiltratiecentrifugebuis, ultrafiltratie-/microfiltratiemembraancassette, virusverwijderingsfilter, tangentiële flowfilterapparaat, diepe membraanstapel, enz. ontwikkeld, die volledig voldoen aan de toepassingsscenario's van biofarmaceutica en celkweek.
Onze membranen en membraanfilters worden veel gebruikt in concentratie, extractie en scheiding van voorfiltratie, microfiltratie, ultrafiltratie en nanofiltratie. Ons brede scala aan productlijnen, van kleine laboratoriumfiltratie voor eenmalig gebruik tot productietype filtratiesystemen, steriliteitstesten, fermentatie, celkweek en meer, kan voldoen aan de behoeften van testen en productie.