Toepassing van ultrafiltratie bij natuurlijke collageenextractie

Collageen heeft als natuurlijke eiwitbron een goede biocompatibiliteit, lage antigeniciteit, biologische afbreekbaarheid en hemostase, zijn strakke spiraalvormige structuur en zijn eigen kenmerken, die allemaal de voorwaarden scheppen voor de industrialisatie ervan. Collageen en zijn bijproducten worden niet alleen gebruikt als verpakkingsmateriaal, cosmetica en gezondheidszorgproducten, maar ook als voedseladditieven om het vleesproduct te verbeteren, en spelen een belangrijke rol, vooral op medisch gebied.

 

Wat is collageen?

 

Collageen is een biologisch macromolecuul, het hoofdbestanddeel van dierlijk bindweefsel, en het meest voorkomende en wijd verspreide functionele eiwit bij zoogdieren, goed voor 25% tot 30% van het totale eiwit, en zelfs tot 80% of meer in sommige organismen. Het speelt de rol van bindend weefsel in dierlijke cellen.

Er wordt gemeten dat het lichaam van een volwassene ongeveer 3 kg collageen bevat, dat voornamelijk voorkomt in de menselijke huid, botten, ogen, tanden, pezen, inwendige organen (waaronder hart, maag, darmen, bloedvaten) en andere delen van het menselijk lichaam. De functie ervan is het behouden van de morfologie en structuur van de huid, weefsels en organen, en het is ook een belangrijke grondstof voor het herstel van verschillende weefsels na letsel.

 

Er zijn veel soorten collageeneiwitten, en de meest voorkomende typen zijn type I, type II, type III, type V en XI. Vanwege de goede biocompatibiliteit, biologische afbreekbaarheid en bioactiviteit wordt collageen op grote schaal gebruikt in de voeding, de geneeskunde, weefselmanipulatie, cosmetica en andere gebieden.

Hoe natuurlijk collageen te extraheren

Dierlijke weefsels van vee en pluimvee zijn voor mensen de belangrijkste manier om natuurlijk collageen en de collageenpeptiden ervan te verkrijgen. Als gevolg van verwante dierziekten en bepaalde religieuze overtuigingen is het gebruik door mensen van collageen en collageenproducten van landzoogdieren echter beperkt, en de ontwikkeling richt zich geleidelijk op mariene organismen. De Europese Autoriteit voor voedselveiligheid (EFSA) heeft bevestigd dat zelfs collageen afkomstig van dierlijke botten niet het potentieel heeft om de gekkekoeienziekte en andere gerelateerde ziekten te infecteren. Vanwege verschillen in aminozuursamenstelling en mate van verknoping hebben waterdieren, vooral het collageen dat rijk is aan hun verwerkingsafval zoals huid, botten en schubben, veel voordelen die collageen van vee niet heeft. Bovendien is collageen afkomstig van zeedieren in sommige opzichten duidelijk superieur aan collageen van landdieren, zoals lage antigeniciteit en hypoallergeniciteit. Daarom kan aquatisch collageen geleidelijk het collageen van landdieren vervangen. Als voorbeeld werd het proces genomen van het extraheren van collageen uit de schubben van graskarpers.

 

Extractie van collageen uit schubben van graskarpers door middel van ultrafiltratiemethode

1. Materialen en methoden

1.1 Proefmonster

Ruw collageen waterig extract.

1.2 Testmethoden

1.2.1 Ultrafiltratieprocesroute

 

1.2.2 Bepaling van het voorfiltratieproces

In deze test worden de vacuümfiltratiemethode en de microfiltratiemethode vergeleken en geanalyseerd om het beste voorfiltratiefiltratieproces te bepalen. De specifieke testmethoden zijn als volgt:

① Het ruwe collageenwaterextract werd gefilterd door vacuümpompen van filtreerpapier om gesuspendeerde deeltjes en onzuiverheden in het waterextract te verwijderen.

② Het ruwe collageenwaterextract werd gefilterd door een 0.2 μm microfiltratiemembraan om onoplosbare stoffen en onzuiverheden in het waterextract te verwijderen.

 

1.2.3 Selectie van de poriegrootte van het ultrafiltratiemembraan

De poriegrootte van het ultrafiltratiemembraan was 100 kDa.

 

1.2.4 Experiment met één factor van het ultrafiltratiezuiveringsproces

Ultrafiltratietechnologie werd gebruikt om ruw collageenwaterextract te zuiveren, en experimenten met één factor over de effecten van bedrijfsdruk, bedrijfstemperatuur en pH-waarde op collageenretentie werden bestudeerd. Nadat de ultrafiltratieapparatuur enige tijd was gestart en gestabiliseerd, werd de invloed van verschillende factoren op de collageenretentie bestudeerd.

 

1.2.5 Berekeningsformule

 

2. Resultaten en analyse

2.1 Analyseresultaten van het voorfiltratieproces

De vergelijkingsresultaten van de twee filtratiemethoden, namelijk vacuümextractie en microfiltratie, worden weergegeven in de volgende tabel.

 

Uit de tabel blijkt dat zowel de vacuümfiltratiemethode als de microfiltratiemethode onzuiverheden en onoplosbare vaste stoffen in de oplossing kunnen verwijderen, maar de microfiltratiemethode heeft een beter beschermend effect op eiwitten, dat wil zeggen dat het verlies niet duidelijk is en dat de vacuümfiltratiemethode dat wel is. gemakkelijk eiwitverlies veroorzaken. Bovendien blijkt de vacuümfiltratiemethode troebel te zijn nadat het filtraat een tijdje is geplaatst, en het microfiltraat is nog steeds helder en transparant, dus microfiltratie wordt gekozen als het voorbehandelingsproces van ultrafiltratie.

 

2.2 Test met één factor van het ultrafiltratieproces

2.2.1 Invloed van ultrafiltratiedruk op retentiesnelheid

Onder de voorwaarde van temperatuur 40 graad en pH=9.0, de invloed van verschillende ultrafiltratiedrukken (0.07 MPa, {{9} }.09 MPa, 0,11 MPa, 0,13 MPa en 0,15 MPa) op eiwitretentie werd onderzocht. De resultaten worden weergegeven in de onderstaande figuur.

Zoals uit de bovenstaande figuur blijkt, neemt de eiwitretentiesnelheid geleidelijk af naarmate de werkdruk toeneemt. Wanneer de werkdruk {{0}}.07 MPa is, is het eiwitretentiepercentage 96,53%, en wanneer de werkdruk 0,15 MPa is, is het eiwitretentiepercentage 84,38%. Dit komt omdat het scheidende effect van ultrafiltratie op stoffen wordt uitgevoerd door het drukverschil. In het bereik van lage werkdruk kunnen kleine moleculen snel door het membraan gaan, terwijl grote moleculen door het ultrafiltratiemembraan kunnen worden opgevangen en zich ophopen op het membraanoppervlak. Op dit moment vormen het membraanoppervlak en het waterextract een concentratieverschil, wat resulteert in de concentratiepolarisatieweerstand. Op dit moment is de druk relatief laag en kan deze geen grote invloed hebben op het retentiepercentage. Met de toename van de druk neemt de concentratiepolarisatieweerstand echter geleidelijk toe en bereikt het concentratieverschil tussen het membraanoppervlak en het waterextract een evenwicht. Wanneer de druk dit evenwicht overschrijdt, kan er een gellaag op het membraanoppervlak worden gevormd (wat consistent is met de theorie dat concentratiepolarisatie en condensatielaag worden gevormd tijdens ultrafiltratie), en de druk blijft toenemen, de dikte van de gellaag neemt toe , en het eiwit dat op het membraanoppervlak achterblijft, neemt ook toe. Dit resulteert in een lager retentiepercentage. Om het scheidingseffect van het membraan te garanderen, is de optimale parameter voor de werkdruk 0,07 MPa.

 

2.2.2 Invloed van temperatuur op eiwitretentie

Onder de omstandigheden van {{0}}.11MPa druk en pH=9.0 zijn de effecten van verschillende temperaturen, namelijk 25 graden, 30 graden, 35 graden, 40 graden en 45 graden, op eiwitten retentie werd bestudeerd. De resultaten worden weergegeven in de onderstaande figuur.

Zoals uit de bovenstaande figuur blijkt, neemt de retentiegraad van het ultrafiltratiemembraan geleidelijk toe met de stijging van de temperatuur, en bereikt het maximum bij 45 graden, met een retentiegraad van 97,01%. Dit komt omdat de viscositeit van collageen nauw verwant is aan de temperatuur. Wanneer de temperatuur laag is, is de viscositeit van collageen groter en is de ophoping van collageen op het membraanoppervlak gemakkelijk om weerstand te vormen, wat resulteert in een lage retentiesnelheid. Wanneer de temperatuur stijgt, neemt de viscositeit van collageen af, wordt de interactie tussen collageenmoleculen verzwakt en neemt de massaoverdrachtssnelheid toe, wordt het concentratiepolarisatiefenomeen verzwakt en neemt de retentiesnelheid toe. Een andere reden voor de toename van de retentiesnelheid is dat de temperatuur stijgt, de oplosbaarheid van collageen ook dienovereenkomstig toeneemt en het fenomeen dat collageen het membraan blokkeert, wordt verminderd, dus de optimale temperatuur voor ultrafiltratie is 45 graden.

 

2.2.3 Invloed van de pH-waarde op eiwitretentie

Onder de omstandigheden van {{0}}.11 MPa druk en 40 graden temperatuur, de invloed van verschillende pH-omstandigheden, namelijk pH=6.0, pH{{ 5}}.{{10}}, pH=8.0, pH=9.0 en pH=10.0, op de retentiesnelheid werden bestudeerd. De resultaten worden weergegeven in de onderstaande figuur.

 

As can be seen from the figure above, in the range of pH 6-7, the protein retention rate decreases with the increase of pH value, and the minimum value is 82.13% when pH=7.0; when pH>7, the retention rate gradually increases with the increase of pH value. This is because the isoelectric point of collagen is pH=7. At the isoelectric point, the protein is in a state of precipitation, which is easy to stay on the surface of the membrane and block the membrane, thus reducing the retention rate. When pH>7, neemt de retentiesnelheid geleidelijk toe met de toename van de pH-waarde. Dit komt omdat het ultrafiltratiemembraan een polyether-esdoornmembraan is met een negatieve lading, en collageen negatief geladen is onder alkalische omstandigheden. De negatief geladen collageenmoleculen vormen een wederzijds exclusieve toestand met het ultrafiltratiemembraan met dezelfde lading, waardoor het niet gemakkelijk is om collageenmoleculen op het oppervlak van het membraan te houden en het membraan te blokkeren. Daarom is de optimale pH-waarde van ultrafiltratie 8-10.

 

2.3 Optimalisatie van ultrafiltratieprocessen en resultaatverificatie

Volgens de analyse van Design-Expert8.05 software zijn de optimale procesparameters: werkdruk 0.14 MPa, bedrijfstemperatuur 40.98 graden, pH van de oplossing{{7 }}.43, en het retentiepercentage is 92,551%. Rekening houdend met de bruikbaarheid van de werkelijke parameters, werden de ultrafiltratieomstandigheden geselecteerd als een werkdruk van 0,14 MPa, een bedrijfstemperatuur van 40 graden en een pH-waarde van 9,50 van de materiaaloplossing, en de testverificatie werd gestart nadat het ultrafiltratiesysteem was gestart en gestabiliseerd. Het resultaat van het retentiepercentage was (92,61±0,1)% (n=3). De voorspelde waarden van de vergelijking zijn in principe vergelijkbaar met de gemeten waarden, wat aantoont dat de resultaten van de voorspelde conditieparameters in overeenstemming zijn met de werkelijke conditieresultaten.

 

2.4 Resultaten van elektroforetische analyse

Het gezuiverde collageen werd geanalyseerd door middel van SDS-PAGE-elektroforese en de resultaten werden getoond in de volgende figuur.

 

Zoals uit de bovenstaande figuur blijkt, is baan 1 het gezuiverde collageen van deze test, en baan 2 het standaard collageenmonster van de kuitpees. Uit SDS-PAGE-elektroforese blijkt dat het collageen in dit onderzoek kan worden geïdentificeerd als collageen, maar de grenzen tussen a1-peptideketen en a2-peptideketen lijken niet duidelijk te zijn. Op de elektroforetische kaart is te zien dat er geen andere eiwitonzuiverheid is, dus kan worden geconcludeerd dat het gezuiverde collageen een hoge zuiverheid heeft.

Over Guidling

 

Guidling Technology is een nationale hightech onderneming die zich richt op biofarmaceutica, celcultuur, zuivering en concentratie van biogeneeskunde, diagnose en industriële vloeistoffen. We hebben met succes centrifugaalfilterapparaten, ultrafiltratie- en microfiltratiecassettes, virusfilters, TFF-systemen, dieptefilters, holle vezels, enz. ontwikkeld. Die volledig voldoen aan de toepassingsscenario's van biofarmaceutica, celcultuur, enzovoort. Onze membranen en membraanfilters worden veel toegepast bij het concentreren, extraheren en scheiden van voorfiltratie, microfiltratie, ultrafiltratie en nanofiltratie. Onze vele productlijnen, van kleine laboratoriumfiltratie voor eenmalig gebruik tot productiefiltratiesystemen, steriliteitstesten, fermentatie, celcultuur en meer, voldoen aan de behoeften van testen en productie. Guidling Technology kijkt ernaar uit om met u samen te werken!