Toepassing vanUltrafiltratie inExtractie vanNnatuurlijkCcollageen

 

Ⅰ.Wat is collageen

Collageen is een biopolymeer, de hoofdcomponent in het bindweefsel van dieren, en tevens het meest voorkomende en wijd verspreide functionele eiwit bij zoogdieren, goed voor 25%-30% van het totale eiwit, en zelfs tot meer dan 80% in sommige gevallen. organismen. Het speelt de rol van bindend weefsel in dierlijke cellen.

Volgens de meting heeft een volwassene ongeveer 3 kg collageen in zijn/haar lichaam, dat voornamelijk aanwezig is in de huid, botten, ogen, tanden, pezen, inwendige organen (waaronder hart, maag, darmen en bloedvaten) en andere delen. van het menselijk lichaam. De functie ervan is het behoud van de morfologie en structuur van huid en organen, en het is ook een belangrijke grondstof voor het herstel van beschadigde weefsels.

II. Extractie van collageen uit graskarperschubben door ultrafiltratie

1. Materialen en methoden

1.1 Proefmonsters

Waterig extract van ruw collageen.

1.2 Testmethoden

1.2.1 Ultrafiltratieproces

1.2.2 Bepaling van het voorfiltratieproces

In deze test wordt het optimale voorfiltratieproces bepaald door de vergelijkende analyse van de vacuümfiltratiemethode en de microfiltratiemethode. De specifieke testmethoden zijn als volgt:

① Het ruwe waterige collageenextract wordt gefilterd door een vacuümfiltratiemethode met filtreerpapier om gesuspendeerde deeltjes en onzuiverheden in het waterige extract te verwijderen.

② Het ruwe waterige collageenextract wordt gefilterd met een 0.2 μm microfiltratiemembraan om onoplosbare stoffen, onzuiverheden enz. uit het waterige extract te verwijderen.

1.2.3 Keuze van de poriegrootte van het ultrafiltratiemembraan

Tijdens zuivering is de poriegrootte van het ultrafiltratiemembraan 100 kDa.

1.2.4 Experiment met één factor van het ultrafiltratiezuiveringsproces

Het waterige extract van ruw collageen wordt gezuiverd door ultrafiltratietechnologie. Bestudeer het experiment met één factor van het effect van werkdruk, bedrijfstemperatuur en pH op collageenretentie. Nadat u de ultrafiltratieapparatuur een tijdje hebt aangezet, onderzoekt u het effect van verschillende factoren op de collageenretentiesnelheid.

1.2.5 Berekeningsformule

2. Resultaten en analyse

2.1 Analyse van het prefiltratieproces

Zie onderstaande tabel voor de vergelijkingsresultaten van de vacuümfiltratiemethode en de microfiltratiemethode.

Filtratiemethode	Oplossingsconcentratie vóór filtratie/(g/l)	Oplossingsconcentratie na filtratie/(g/l)	Sensorische verschijnselen
vacuümfiltratiemethode	0.45	0.35	De oplossing is helder aan het einde van de filtratie, maar wordt troebel nadat deze een tijdje met rust is gelaten.
microfiltratie methode	0.45	0.42	De oplossing is helder aan het einde van de filtratie en blijft helder nadat deze een tijdje met rust is gelaten

 

Uit de tabel blijkt dat zowel de vacuümfiltratiemethode als de microfiltratiemethode de onzuiverheden en onoplosbare vaste stoffen in de oplossing kunnen verwijderen, maar de microfiltratiemethode heeft een beter beschermend effect op eiwitten, dat wil zeggen dat het verlies niet significant is, en de vacuümfiltratiemethode kan verlies aan eiwitten veroorzaken. Bovendien is het filtraat troebel nadat het een tijdje door vacuümfiltratie is geplaatst, terwijl de microfiltratie nog steeds helder en transparant is, daarom wordt microfiltratie geselecteerd als het voorbehandelingsproces van ultrafiltratie.

2.2 Test met één factor van het ultrafiltratieproces

2.2.1 Effect van ultrafiltratiedruk op de retentiesnelheid

Onder de voorwaarde van temperatuur 40 graad en pH 9.0, bestudeer de effecten van verschillende ultrafiltratiedrukken (0.07 MPa, 0.{ {11}}9 MPa, 0,11 MPa, 0,13 MPa en 0,15 MPa) op de eiwitretentiesnelheid. De resultaten worden weergegeven in de onderstaande figuur.

 

Zoals uit de bovenstaande figuur blijkt, nam met de toename van de werkdruk de onderscheppingssnelheid van eiwitten geleidelijk af. Bij {{0}}.07 MPa is het eiwitretentiepercentage 96,53%, wanneer de werkdruk 0,15 MPa is, is het eiwitretentiepercentage 84,38%. Dit komt omdat de scheiding van stoffen door ultrafiltratie wordt aangedreven door het drukverschil. In dat bereik van lage werkdruk kunnen kleine moleculaire stoffen snel door het membraan gaan, maar macromoleculaire stoffen kunnen worden opgevangen door het ultrafiltratiemembraan en zich ophopen op het oppervlak van het membraan, en op dit moment kunnen het oppervlak van het membraan en de waterige extractie uit concentratieverschil om concentratieverschil-polarisatieweerstand te veroorzaken; met de toename van de druk neemt de concentratiepolarisatieweerstand echter geleidelijk toe en bereikt het concentratieverschil tussen het membraanoppervlak en het waterige extract een evenwicht. Wanneer de druk dit evenwicht overschrijdt, zou er een gellaag op het membraanoppervlak kunnen worden geschreven (wat consistent was met de theorie van concentratiepolarisatie en gellaag gevormd tijdens ultrafiltratie). De druk blijft toenemen en de dikte van de gellaag neemt toe, en het eiwit dat op het membraanoppervlak achterblijft neemt toe, wat resulteert in een lage retentiesnelheid. Om het scheidingseffect van het membraan te garanderen, is de optimale bedrijfsdrukparameter 0,07 MPa.

2.2.2 Effect van temperatuur op de eiwitretentiesnelheid

Onder de voorwaarde van druk {{0}}.11 MPa, pH 9,0, bestudeer de effecten van verschillende temperaturen (25 graden, 30 graden, 35 graden, 40 graden en 45 graden) op de eiwitretentie. De resultaten worden weergegeven in de onderstaande figuur.

 

Zoals weergegeven in de bovenstaande figuur, neemt de retentiegraad van het ultrafiltratiemembraan geleidelijk toe naarmate de temperatuur stijgt, en bereikt het maximum bij 45 graden, waarbij de retentiegraad 97,01% is. Omdat de viscositeit van collageen nauw verband houdt met de temperatuur: wanneer de temperatuur lager is, is de viscositeit van collageen groter, en dus vormt het collageen gemakkelijk weerstand op het oppervlak van het membraan, wat resulteert in een lage retentiesnelheid. Wanneer de temperatuur stijgt, neemt de viscositeit van collageen af ​​en wordt de interactie tussen collageenmoleculen verzwakt, zodat de massaoverdrachtssnelheid toeneemt en de concentratiepolarisatie verzwakt, waardoor de retentiesnelheid toeneemt. Een andere reden voor de toename van de retentiesnelheid is dat de temperatuur stijgt, en de oplosbaarheid van collageen dienovereenkomstig toeneemt, en het fenomeen dat collageen het membraan blokkeert, wordt verminderd. Daarom is de optimale temperatuur voor ultrafiltratie 45 graden.

2.2.3 Effect van pH op eiwitretentie

Onder de voorwaarde van druk {{0}}.11 MPa en temperatuur 40 graad, bestudeer de effecten van verschillende pH-omstandigheden, namelijk pH=6.0, pH{ {5}}.{{10}}, pH=8.0, pH=9.0 en pH=10.0, op het retentiepercentage . De resultaten worden weergegeven in de onderstaande figuur.

 

As shown in the above figure, within the pH value range of 6–7, with the increase of pH value, the protein retention rate decreases, and there is a minimum value of 82.13% at pH=7.0. When pH>7, with the increase of pH value, the retention rate gradually increases. This is because the isoelectric point of collagen pH=7, at the isoelectric point of protein is a precipitation state, easy to stay on the surface of the membrane block membrane, so that the retention rate is low; When pH>7, neemt de retentiesnelheid geleidelijk toe met de toename van de pH. Dit komt omdat het ultrafiltratiemembraan een polyether-esdoornmembraan is met negatieve lading, collageen met negatieve lading onder alkalische omstandigheden, negatief geladen collageenmoleculen en ultrafiltratiemembraan met dezelfde lading een wederzijds uitsluitende toestand vormen, zodat collageenmoleculen niet gemakkelijk op het oppervlak blijven. van het membraan, het is niet gemakkelijk om het membraan te blokkeren, dus de optimale pH van ultrafiltratie is 8-10.

2.3 Ultrafiltratieprocesoptimalisatie en resultaatvalidatie

Uit analyse door Design-Expert8.05 software blijkt dat de optimale procesparameters als volgt zijn: werkdruk 0.14 MPa, bedrijfstemperatuur 40,98 graden en pH van de oplossing=9.43. Onder deze omstandigheden bedroeg het retentiepercentage 92,551%. Rekening houdend met de bruikbaarheid van de werkelijke parameters, is de bedrijfsdruk 0,14 MPa, de bedrijfstemperatuur 40 graden en de pH-waarde van de voedingsvloeistof 9,50 onder ultrafiltratieomstandigheden. De experimentele verificatie wordt gestart nadat het systeem van het ultrafiltratieapparaat stabiel is geworden. Het verkregen retentiepercentageresultaat is (92.61 0.1)% (n=3). De voorspelde waarde van de vergelijking is in principe gelijk aan de gemeten waarde, wat aangeeft dat het voorspelde resultaat van de voorwaardelijke parameter in overeenstemming is met het werkelijke voorwaardelijke resultaat.

2.4 Resultaten van elektroforese-analyse

Het gezuiverde collageen wordt geanalyseerd door middel van SDS-PAGE-elektroforese en de resultaten worden weergegeven in de onderstaande figuur.

Zoals weergegeven in de bovenstaande figuur is baan 1 het gezuiverde collageen in dit experiment en baan 2 het standaard collageenmonster van de kuitpees. Uit de SDS-PAGE-elektroforese kon worden afgeleid dat het in dit experiment voorgestelde collageeneiwit als collageen kon worden geïdentificeerd, maar de ogenschijnlijk onduidelijke grenzen van de a1-peptideketen en de a2-peptideketen zijn niet duidelijk. Uit de elektroforese blijkt duidelijk dat er geen andere eiwitbanden zijn, en er kon worden geconcludeerd dat de zuiverheid van gezuiverd collageen hoog is.