Volledige analyse van het productieproces van MRNA-geneesmiddelen: hoe TFF-technologie zuiveringsuitdagingen oplost
De afgelopen jaren heeft de mRNA-technologie baanbrekende vooruitgang geboekt op biofarmaceutisch gebied, wat een enorm toepassingspotentieel aantoont, vooral in vaccins en gentherapie. De succesvolle ontwikkeling van mRNA-vaccins heeft niet alleen nieuwe oplossingen opgeleverd voor de preventie en beheersing van infectieziekten, maar heeft ook geleid tot vooruitgang op het gebied van kankerimmunotherapie en gepersonaliseerde geneeskunde. Als een nieuwe klasse van therapeutische producten is de grootschalige productie van mRNA op grote schaal een grote uitdaging, waarbij controle van de RNA-stabiliteit, verwijdering van resterende enzymen en reactiebijproducten, bufferuitwisseling en het bereiken van hoge- zuiverheidsherstelpercentages betrokken zijn, waarvoor allemaal productietechnologieën met door de regelgeving goedgekeurde oplossingen nodig zijn.
Het productieproces van mRNA-vaccins of therapieën is hoofdzakelijk verdeeld in drie fasen: bereiding van plasmide-DNA-bulkoplossing, bereiding van mRNA-bulkoplossing en bereiding van mRNA-LNP-medicijnproduct.
Stroomschema voor het productieproces van mRNA-geneesmiddelen
Tangentiële stroomfiltratie (TFF), als een gevestigde- membraanscheidingstechnologie, wordt op grote schaal toegepast bij de productie van mRNA vanwege het hoge- efficiënte moleculaire zeefvermogen, de regelbare bufferuitwisseling en de lage schuifspanningseigenschappen. Gebaseerd op het ontwerp van membraanmodules, omvatten gebruikelijke TFF-configuraties platte-velcassettes en holle-vezelmodules. Bovendien kan druk-gedreven membraanscheiding in TFF worden geclassificeerd in microfiltratie (MF), ultrafiltratie (UF), nanofiltratie (NF) en omgekeerde osmose (RO) op basis van de poriegrootte van het membraan, met geleidelijk toenemende selectiviteit.
TFF speelt een cruciale rol in meerdere fasen van de productie van mRNA-geneesmiddelen, waaronder de bereiding van plasmide-DNA-bulk, mRNA-bulkproductie en de uiteindelijke formulering van mRNA-LNP-medicijnproducten. Door de juiste selectie van membraantype, molecuulgewicht-off (MWCO) en membraanmateriaal maakt TFF een efficiënte verwijdering van reactiebijproducten en laag-moleculaire- onzuiverheden mogelijk, terwijl ook de uitwisseling en concentratie van buffers zowel voor als na LNP-inkapseling wordt vergemakkelijkt. Dit verbetert de zuiverheid, stabiliteit en algehele processchaalbaarheid van RNA aanzienlijk.
Bovendien worden de prestaties van tangentiële stroomfiltratie beïnvloed door systeemconfiguratiefactoren zoals pomptype en slangontwerp, evenals door belangrijke procesparameters, waaronder transmembraandruk (TMP), schuifspanning en filtratieflux. Deze factoren moeten zorgvuldig worden geselecteerd en geoptimaliseerd op basis van de kenmerken van het doelproduct, vooral voor stress-gevoelige producten zoals mRNA-LNP, die tijdens de verwerking zeer gevoelig zijn voor externe mechanische krachten.
Zuivering van plasmide-DNA
De bereiding van een plasmide-DNA-voorraadoplossing is fundamenteel gebaseerd op het sequentieontwerp van de transcriptiesjabloon. De bereidingsmethoden omvatten doorgaans plasmide-DNA-amplificatie, hoewel PCR-amplificatie ook kan worden gebruikt. Als we DNA-amplificatie als voorbeeld nemen, engineeredE. coliwordt vaak gebruikt voor amplificatie op basis van fermentatie-. Het stroomafwaartse zuiveringsproces omvat voornamelijk celverzameling, lyse en klaring, concentratie en bufferuitwisseling, steriele filtratie, linearisatie en chromatografische zuivering. In industriële omgevingen wordt vaak centrifugatie met continue-stroom gebruikt voor het verzamelen van cellen, maar dit genereert relatief hoge schuifkrachten. Hollevezelsystemen, met hun open kanalen en lage afschuiving, zijn geschikter voor het hanteren van monsters met een hoog vastestofgehalte, hoge viscositeit of afschuifgevoeligheid, zoals plasmide-DNA. Na verzameling worden de cellen onderworpen aan hogedrukhomogenisatie, ultrasone trillingen of alkalische lyse, gevolgd door voorlopige klaring door middel van dieptefiltratie.
Om daaropvolgende chromatografie te vergemakkelijken, wordt vaak eerst tangentiële stroomfiltratie (TFF) met behulp van membraancassettes of holle vezelkolommen met molecuulgewichtsgrenzen van 30 kDa, 100 kDa of 300 kDa gebruikt voor concentratie en bufferuitwisseling. Dit vermindert het monstervolume en verwijdert tegelijkertijd enkele onzuiverheden zoals RNA, gastheerceleiwitten (HCP) en DNA-fragmenten van de gastheercel (HCD). Chromatografie dient als de belangrijkste zuiveringsstap. Typisch wordt anionenuitwisselingschromatografie (AEX) gecombineerd met hydrofobe interactiechromatografie (HIC) om onzuiverheden efficiënt te verwijderen en zeer bioactief supercoiled plasmide-DNA te verrijken, waardoor de plasmidezuiverheid aanzienlijk wordt verbeterd.
Na zuivering wordt het plasmide opnieuw onderworpen aan TFF om de oplossing te concentreren tot de doelconcentratie (meestal 0,5-2 mg/ml) en om dialyse uit te voeren met de uiteindelijke opslagbuffer. Deze stap verwijdert resterende zouten en organische oplosmiddelen uit het proces en zorgt ervoor dat het buffersysteem voldoet aan de vereisten voor stroomafwaartse in vitro transcriptie (IVT) reacties.
Zuivering van in vitro getranscribeerd (IVT) mRNA
In vitro transcriptie (IVT) en modificatie zijn de belangrijkste processen voor de bereiding van mRNA-voorraadoplossingen. Tijdens de IVT-mRNA-productie wordt een combinatie van tangentiële stroomfiltratie (TFF1) – chromatografie – tangentiële stroomfiltratie (TFF2) gebruikt. Deze strategie zorgt voor een efficiënte en hoogwaardige zuivering van mRNA-, en biedt cruciale ondersteuning voor de productie van vaccins.
Nadat de transcriptie- en modificatiereacties zijn voltooid, wordt doorgaans eerst ultrafiltratie/diafiltratie met behulp van membraancassettes of holle-vezelkolommen met een molecuulgewichtsgrens van 30 kDa, 100 kDa of 300 kDa uitgevoerd. Deze stap verwijdert effectief verschillende proces-gerelateerde onzuiverheden uit het reactiesysteem, zoals RNA-polymerase, resterende DNA-fragmenten, niet-gereageerde NTP's, capping-enzymen, dubbel-strengig RNA (dsRNA) en kleine- molecuulremmers, terwijl tegelijkertijd bufferuitwisseling wordt bereikt. Na een enkele tangentiële stroomfiltratiestap worden de meeste onzuiverheden effectief verwijderd, en de enige detecteerbare resterende eiwitonzuiverheid is RNA-polymerase.
Vervolgens worden meerdere chromatografietechnieken toegepast voor verdere zuivering. Veelgebruikte methoden zijn onder meer affiniteitschromatografie, grootte-uitsluitingschromatografie, ion-paar omgekeerde-fasechromatografie en ion-uitwisselingschromatografie. Door deze combinatie van ultrafiltratie en sequentiële chromatografie bereikt het mRNA een hoge zuiverheid.
Om aan de formulerings- of opslagvereisten te voldoen, wordt de mRNA-voorraadoplossing opnieuw geconcentreerd of verdund met behulp van membraancassettes van 30 kDa, 100 kDa of 300 kDa of holle-vezelkolommen om de doelconcentratie nauwkeurig aan te passen en uit te wisselen in de uiteindelijke formuleringsbuffer. Ten slotte wordt steriele-filtratie toegepast om de microbiële belasting onder controle te houden, waardoor de tijdelijke opslag en het vullen van het materiaal wordt voltooid.
Exploration of TFF-related process parameters: Relevant studies have shown that a membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 kDa provides the optimal purification efficiency; the transmembrane pressure (TMP) should not exceed 5 psi; and an mRNA concentration of 1 mg/mL ensures a relatively high permeate flux (>25LMH).
Zuivering van mRNA-LNP-formuleringen
Lipide nanodeeltjes (LNP's) zijn momenteel het meest uitgebreid bestudeerde toedieningssysteem voor mRNA-therapieën. Momenteel bevinden verschillende mRNA-LNP-formuleringen zich in verschillende stadia van preklinische en klinische ontwikkeling. LNP's zijn zeer gevoelig voor productieprocessen. Van de eenheidsbewerkingen die nodig zijn voor de productie van mRNA-LNP vormen concentratie en bufferuitwisseling via tangentiële stroomfiltratie (TFF) en steriele filtratie aanzienlijke uitdagingen. Deze stappen moeten zorgvuldig worden geoptimaliseerd om de schaalbaarheid van het proces en de productkwaliteit te garanderen, terwijl problemen zoals membraanvervuiling en onjuiste filtervulling worden vermeden.
Na inkapseling van mRNA wordt tangentiële stroomfiltratie (TFF) gebruikt voor zuivering. Het doel van deze stap is het verwijderen van niet-ingekapseld mRNA, vrije polymeren of lipidematerialen, evenals resterende oplosmiddelen uit mRNA en lipiden. Omdat mRNA-LNP's beperkte stabiliteit vertonen bij kamertemperatuur, is optimalisatie van stroomafwaartse processen, inclusief TFF, van cruciaal belang voor het behoud van de productkwaliteit.
De belangrijkste optimalisatierichtingen zijn onder meer: het op de juiste manier instellen van de transmembraandruk (TMP) en de tangentiële stroomsnelheid op basis van de deeltjesgrootte en stabiliteit van mRNA-LNP's om de filtratie-efficiëntie en deeltjesstress in evenwicht te brengen; het selecteren van membranen of holle-vezelkolommen met geschikte molecuulgewichtsgrenzen (MWCO, bijvoorbeeld 100 kDa of 300 kDa) om op efficiënte wijze vrij mRNA, onzuiverheden en uitwisselingsbuffer te verwijderen, terwijl de adsorptie of schade van deeltjes wordt geminimaliseerd; en het optimaliseren van de concentratie- en diafiltratievolumes om effectieve bufferuitwisseling in de doelformulering te garanderen en de uiteindelijke deeltjesconcentratie en dispersiteit te controleren.
Bovendien moeten kritische kwaliteitskenmerken (zoals deeltjesgrootte, polydispersiteitsindex [PDI] en mRNA-inkapselingsefficiëntie) nauwlettend worden gevolgd tijdens het proces, en moeten de parameters dynamisch worden aangepast op basis van real-gegevens om een stabiele, schaalbare en efficiënte zuivering en formulering van mRNA-LNP's te bereiken.
Bovendien wordt, vanwege de instabiliteit van mRNA-LNP's en hun componenten onder terminale sterilisatiemethoden, doorgaans een steriel--filter van 0,2 µm gebruikt om bacteriën en andere microbiële verontreinigingen te verwijderen.