Hoe de juiste ultrafiltratiebuis te kiezen?
Ultrafiltratiebuizen die gewoonlijk worden gebruikt voor eiwitconcentratie en buffervervanging worden vaak gebruikt in ultrafiltratiebuizen. Er zijn andere modellen met verschillende volumegroottes en ultrafiltratiebuizen, afhankelijk van het molecuulgewicht van het doeleiwit, het volume vóór de concentratie en het beoogde concentratievolume. Herbruikbaar.
1. Kies een geschikte ultrafiltratiebuis, vooral rekening houdend met MWCO en concentratievolume. In het algemeen mag het molecuulgewicht niet groter zijn dan 1/3 van het molecuulgewicht van het doeleiwit. Als het molecuulgewicht van het doeleiwit ongeveer 10 kd is, kan een ultrafiltratiebuis met een vastgehouden molecuulgewicht van 3 KD worden gebruikt.
2. De nieuw aangeschafte ultrafiltratie is droog. Voeg milliq water toe voor gebruik. Het water gaat volledig door het membraan en wordt enkele minuten voorgekoeld in een ijsbad of koelkast. Giet vervolgens het water weg om de eiwitoplossing toe te voegen. De hoeveelheid eiwitoplossing mag de witte lijn op de bovenkant van de reageerbuis niet overschrijden. Gemakkelijke operatie. Voordat de eiwitoplossing wordt toegevoegd, moet de ultrafiltratiebuis voor voorkoeling in het ijs worden gestoken.
3. Balans. De massa en het zwaartepunt moeten in evenwicht zijn. Houd er rekening mee dat de snelheid en versnelling niet te snel mogen zijn, anders wordt het ultrafiltratiemembraan direct beschadigd. Start centrifugale ultrafiltratie (voorkoelen van de centrifuge tot 4 graden). De richting van het diafragma en de roterende as kunnen worden aangepast volgens de instructies (in het geval van een hoekcentrifuge staat het diafragma loodrecht op de as). Bij daadwerkelijk gebruik is het algemene toerental lager dan aangegeven in de handleiding, wat de levensduur van de centrifugaalleiding kan verlengen.
4. wanneer geconcentreerd tot de resterende 1 ml, [neem de 50 ul huishoudelijke Bradford-oplossing, voeg 10 ul vloeistof toe om te zien of deze blauw wordt en bepaal of de ultrafiltratiebuis het eiwit lekt. Als de buis lekt, giet u deze in de bovenste laag en stroomt u terug naar de nieuwe buis om ultrafiltratie te starten. Om nauwkeurig te bepalen of de reageerbuis lekt, gelieve 5mg 10min 10min te centrifugeren, vervolgens door te laten, de eiwitgel of Bradford] [grove meting] te laten lopen. Blijf de resterende eiwitoplossing toevoegen om te concentreren (werk op ijs om eiwitverwarming te voorkomen) totdat alle geconcentreerde oplossingen zijn toegevoegd. Let er tijdens het centrifugeren op of er eiwitprecipitatie optreedt en verstopping van de buis veroorzaakt. Als er neerslag optreedt, bepaal dan de specifieke oorzaak van de neerslag, of de eiwitconcentratie te hoog is of dat de buffer niet geschikt is; Het eerste kan worden opgelost door meerdere ultrafiltratiebuizen tegelijk te gebruiken om de concentratie te verlagen, terwijl het laatste verschillende buffers kan veranderen totdat het eiwit neerslaat.
5. De voorgaande stappen worden gebruikt om eiwit te concentreren. Als de buffer moet worden vervangen en de totale eiwitoplossing is geconcentreerd tot ongeveer 1 ml, voeg dan voorzichtig een nieuwe buffer toe (ultrafiltratie door 0.22um ultrafiltratiemembraan) en concentreer vervolgens driemaal continu tot ongeveer 1 ml, dus dat de uiteindelijke concentratie afhangt van de vereiste eiwitconcentratie, die gewoonlijk niet meer dan 500 ul of minder dan 200 ul is. Volgens de volumeconcentratie van minstens 10 keer per keer, is het meer dan 1000 keer die van drie keer, wat in principe het doel van het veranderen van de buffer kan bereiken.
6. Verwijder het uiteindelijke eiwitconcentraat. Werk op ijs. Gebruik een gele pipetpunt (200ul), steek de pipetpunt voorzichtig langs de rand, blaas zachtjes en meng de eiwitoplossing. Zorg ervoor dat u het ultrafiltratiemembraan niet aanraakt. Zuig de geconcentreerde oplossing elke keer op tot 200 ul totdat deze volledig is opgezogen. Het is niet nodig om de laatste geconcentreerde oplossing op de bodem van de reageerbuis te extraheren, anders wordt het te moeilijk en kan het ultrafiltratiemembraan worden beschadigd. Ten slotte wordt milliq water aan de ultrafiltratiebuis toegevoegd zonder door het ultrafiltratiemembraan te gaan om waterverlies en uitdroging van het membraan te voorkomen.
7. Hieronder volgen de stappen voor het behandelen van de ultrafiltratiebuis en het hergebruik van de ultrafiltratiebuis.
8. Giet water in de ultrafiltratiebuis en spoel enkele malen voorzichtig af met milliq water. [Als er duidelijke eiwitprecipitatie op de bodem van het reageerbuisje is, kun je eerst water toevoegen en dan wegblazen met een pipet. Zorg ervoor dat u het membraan niet aanraakt. Het sediment hangt naar beneden en loopt dan weg. Je kunt het niet doorspoelen met kraanwater. Na toevoeging van 0,2m NaOH-oplossing, plaats deze gedurende 20 minuten op kamertemperatuur en balanceer de ultrafiltratiebuis gedurende deze periode. Centrifugeer nog 10 minuten. Giet de resterende NaOH-oplossing uit en dompel de katoenen kern onder in het bekerglas (1 of 2L) Milliq-water, gedurende enkele uren geplaatst en vervolgens vervangen door nieuw water, geplaatst gedurende enkele uren om de concentratie van NaOH continu te verdunnen. Was de reageerbuis van 50 ml en dek af met kraanwater, en was de binnenwand met milliq water.
9. Haal de kern van de ondergedompelde reageerbuis eruit, voeg deze toe aan het volle milliq water en vul vervolgens de reageerbuis van 50 ml met milliq water. Doe de buiskern langzaam in 50 ml.
Centrifugeerbuis, giet het water af en verdeel het, dek af en bewaar bij 4 graden tot het volgende gebruik. Over het algemeen zal elke buis, volgens de bovenstaande stappen en voorzorgsmaatregelen, niet binnen drie of vier jaar breken.
