Industriële-schaal stroomafwaartse zuivering van bacteriofagen — sectie 'Zuivering' en 'Ultrafiltratie'

Bacteriofagen, ook wel fagen genoemd, zijn virussen die bacteriën infecteren. Een faag kan niet alleen overleven; het moet een gastheerbacterie parasiteren om zich te kunnen voortplanten, waardoor de bacterie uiteindelijk gaat lyseren. Vanwege hun unieke eigenschappen kunnen fagen klinisch worden gebruikt voor bacteriële identificatie en typering, evenals voor de behandeling van bepaalde refractaire bacteriële infecties.

Dit is een schematisch diagram van een bacteriofaagstructuur (bron: internet).

 

Er wordt geschat dat plantenziekten elk jaar meer dan 30% van de wereldwijde oogstverliezen veroorzaken. Van de verschillende pathogenen zijn bacteriële ziekten bijzonder moeilijk te bestrijden. Traditionele controlemethoden zijn voornamelijk gebaseerd op antibiotica en op koper-gebaseerde middelen. Het overmatig gebruik van antibiotica heeft echter geleid tot steeds ernstigere antimicrobiële resistentie, terwijl het langdurig gebruik van koperverbindingen leidt tot accumulatie in het milieu, wat gezondheidsrisico's met zich meebrengt voor mens en dier.

 

Omdat bacteriofagen een hoge specificiteit hebben, kunnen ze selectief pathogene bacteriën doden zonder nuttige microben of andere gastheercellen te beschadigen. Daarom kunnen fagen dienen als alternatief voor antibiotica en op koper-gebaseerde middelen. Door middel van faagtherapie kunnen ziekteverwekkers effectief worden geëlimineerd, terwijl het gebruik van antibiotica en koperverbindingen wordt verminderd.

 

Met voortdurende wetenschappelijke en technologische vooruitgang en diepgaander onderzoek naar bacteriofagen worden de vooruitzichten voor het gebruik van fagen om superbacteriën te behandelen steeds veelbelovender. Er wordt verwacht dat faagtherapie in de toekomst een van de belangrijkste oplossingen voor antibioticaresistentie zal worden. Door voortdurend onderzoek en verkenning kan faagtherapie een belangrijke kracht worden op het gebied van antimicrobiële behandeling, en een grotere bijdrage leveren aan de menselijke gezondheid.

 

Er blijft echter nog één grote uitdaging bestaan ​​om bacteriofagen veilig en effectief aan het menselijk lichaam toe te dienen,-vooral via intraveneuze (IV) injectie-:hoe je ultra-zuivere faagpreparaten kunt verkrijgen.

Faaglysaat is een complex mengsel dat, naast de doelfagen, belangrijke onzuiverheden bevat, zoals: gastheerbacteriën en hun fragmenten, genomisch DNA en gastheereiwitten (gastheer-gerelateerde onzuiverheden); endotoxinen zoals lipopolysachariden (LPS) (proces-gerelateerde onzuiverheden); en product-gerelateerde onzuiverheden, waaronder lege capsiden en gebroken staarten.

Daarom is het doel van de zuivering niet alleen het bereiken van een hoge faagtiter, maar ook het reduceren van onzuiverheden-met name endotoxinen, gastheer-DNA en eiwitten-tot extreem lage niveaus, zoals gespecificeerd door de standaarden van de farmacopee.

Een robuust en schaalbaar faagzuiveringsproces volgt over het algemeen de gemeenschappelijke principes van stroomafwaartse verwerking en kan worden onderverdeeld in de volgende logische stappen:

Stroomafwaarts zuiveringsproces van bacteriofagen

 

Verduidelijking – Verwijdering van macroscopische onzuiverheden

In de beginfase van de bacteriofaagzuivering is het primaire doel van de klaringsstap het efficiënt verwijderen van intacte bacteriële cellen en groot cellulair afval uit het ruwe lysaat. Het kerndoel van deze stap is het verschaffen van een schone voeding voor stroomafwaartse chromatografiekolommen of membraanscheidingseenheden, waardoor de belasting van vaste deeltjes wordt geminimaliseerd. Dit voorkomt op effectieve wijze verstoppingen in daaropvolgende zuiveringseenheden, waardoor een stabiele werking en een hoge procesefficiëntie gedurende de gehele zuiveringsworkflow worden gegarandeerd.

Bij traditionele bacteriofaag-stroomafwaartse processen is de klaring doorgaans afhankelijk van centrifugatie op lage -snelheid gecombineerd met meer- dieptefiltratie in meerdere fasen- die doorgaans achtereenvolgens door filters van 0,8 μm, 0,45 μm en 0,22 μm gaat- om op effectieve wijze afval en onzuiverheden van de gastheercel te verwijderen. Hoewel volwassen en betrouwbaar, omvat deze aanpak meerdere stappen, is tijdrovend-en vereist herhaalde materiaaloverdrachten, waardoor er ruimte overblijft voor optimalisatie van de algehele opbrengst en efficiëntie.

 

Vervanging van de meer-trapsdieptefiltratie door eenmicrofiltratie capsulekan het proces aanzienlijk vereenvoudigen en intensiveren. Concreet kan het lysaat, na het verwijderen van het meeste celafval door centrifugatie op lage- snelheid, direct worden verwerkt doortangentiële stroomfiltratie (TFF)met behulp van microfiltratiecapsules met gedefinieerde poriegroottes (0,45 μm of 0,22 μm). Dit maakt de fijne verwijdering van deeltjesvormige onzuiverheden en efficiënte permeatie van doelfagen in a mogelijkenkele stap, waarbij de traditionele drie filtratiefasen effectief in één worden geïntegreerd.

Deze innovatie vermindert niet alleen de bedieningstijd en handmatige bediening aanzienlijk, maar minimaliseert ook monsterverlies en besmettingsrisico veroorzaakt door meerdere filtratiestappen, waardoor het algehele faagherstel wordt verbeterd. Ondertussen vermindert de tangentiële stroomwerking membraanvervuiling, verbetert de doorvoer en versterkt de procesrobuustheid.

 

Daarom is het aannemen van eengeïntegreerde klaringsstrategie die centrifugatie op lage-snelheid en microfiltratiecapsules combineertvertegenwoordigt een effectieve aanpak om de efficiëntie en kosten-effectiviteit van grootschalige- productie van bacteriofagen te verbeteren. De microfiltratiecapsules van Guidling Technology kunnen doorgaans de troebelheid van het voer tot onder het niveau reduceren20 NTU, volledig voldoend aan de eisen van daaropvolgende ultrafiltratie- en chromatografiestappen.

 

Opvang en concentratie – Primaire zuivering en volumereductie

Tijdens devangen en concentrerenTijdens de fase van de bacteriofaagzuivering is het hoofddoel het efficiënt terugwinnen van fagen uit grote volumes geklaard lysaat, terwijl tegelijkertijd de primaire productconcentratie en bufferuitwisseling worden bereikt. Deze stap is voornamelijk afhankelijk vanTangentiële stroomfiltratie (TFF)technologie.

 

Het principe van TFF ligt in het gebruik van ultrafiltratiemembranen met een specifiek molecuulgewicht-(doorgaans 100 of 300 kDa). Kleine moleculaire onzuiverheden zoals resterende componenten van kweekmedia, metabolieten en kleine eiwitten passeren selectief de membraanporiën, terwijl fagen in het retentaat worden vastgehouden als gevolg vaneffecten van uitsluiting van grootte, waardoor hun effectieve scheiding en verrijking mogelijk wordt.

Binnen een TFF-systeemultrafiltratie moduswordt gebruikt om volumeconcentratie te bereiken, terwijl wordt overgeschakeld naardiafiltratie modusmaakt bufferuitwisseling mogelijk, waardoor geschikte fysisch-chemische omstandigheden worden gecreëerd voor daaropvolgende stappen zoals enzymatische behandeling.

Deze technologie biedt de gecombineerde voordelen vanhoge verwerkingsefficiëntieEnuitstekende schaalbaarheid, waardoor het ideaal is voor productie op grote- schaal. Volgens GuidlingTechnology bereiken de ultrafiltratiecapsules doorgaans eenfaagherstelpercentage van 90-95%, afhankelijk van het specifieke materiaal dat wordt verwerkt.

 

Diepe zuivering – gerichte verwijdering van kritieke onzuiverheden

Bij bacteriofaagzuivering wordtdiepe zuiveringis de belangrijkste stap die de kwaliteit van het eindproduct bepaalt. Het voornaamste doel is hetspecifieke verwijdering van kritische onzuiverheden, zoals endotoxinen. TraditioneelCentrifugatie van CsCl-dichtheidsgradiënt-vanwege de giftigheid en het gebrek aan schaalbaarheid-is het geëlimineerd uit industriële processen. De huidige benaderingen richten zich opop chromatografie-gebaseerde technologieën, met innovatieve integratie vanenzymvoorbehandeling.

 

Een geavanceerde strategie die combineertanionenuitwisselingschromatografie (AEC)metvoorbehandeling met alkalische fosfatase (AP).is ontwikkeld. Zowel fagen als lipopolysachariden (LPS) hebben negatieve ladingen, wat leidt tot concurrentie om bindingsplaatsen in conventionele AEC-processen en co-elutie veroorzaakt die de zuiveringsefficiëntie vermindert. Door AP-voorbehandeling te introduceren vóór AEC-lading, verwijdert het enzym specifiek fosfaatgroepen uit de lipide A- en kernpolysacharidegebieden van LPS-moleculen, waardoor hun netto negatieve lading aanzienlijk wordt verminderd. Dit verzwakt effectief hun affiniteit voor het anionenuitwisselingsmedium.

Experimentele gegevens tonen aan dat behandeling van het monster met20 E/ml APgevolgd door zuivering met behulp vanquaternaire amine (Q)-ligandmembraanadsorbers of monolithische kolommenkan bereiken tot98,8% verwijdering van endotoxinen, terwijl uitstekende faagherstelpercentages behouden blijven. Deze aanpak lost met succes het al lang bestaande probleem van de co-adsorptie van endotoxinen tijdens faagzuivering op

Polijsten – Laatste verfijning en formulering

 

In de finalepolijst fasevan bacteriofaagzuivering is het hoofddoel het bereiken van ultieme zuiverheid en gereedheid voor formulering. Dit omvat het verwijderen van sporen van resterende onzuiverheden, het elimineren van additieven die tijdens het proces worden geïntroduceerd (zoals alkalische fosfatase) en het volledig omruilen van het product in een formulering-compatibel buffersysteem.

Dit wordt doorgaans bereikt viasecundaire diafiltratie, een beproefde en efficiënte methode die zowel een diepgaande verwijdering van kleine{0}} verontreinigingen als een grondige bufferuitwisseling mogelijk maakt.

 

Om de productzuiverheid verder te verbeteren,waterstof-bindingsinteractiechromatografieofgemengde-moduschromatografie (MMC)kan worden geïntroduceerd als eenlaatste polijststap. Deze technieken maken gebruik van multidimensionale scheidingsmechanismen om sporencomponenten te verwijderen met fysisch-chemische eigenschappen die vergelijkbaar zijn met die van de doelfaag. Het resultaat is een sterk gezuiverd bacteriofaag actief farmaceutisch ingrediënt (API) dat voldoet aan de strenge kwaliteitsnormen die daarvoor vereist zijnformuleringen van injectie-kwaliteit.

Door een combinatie van microfiltratie- en ultrafiltratiemembraanmodules met een membraanoppervlak van 1 m² te selecteren, bereikt het geschatte maximale volume bacteriofaag dat kan worden verwerkt maximaal 100 liter. De microfiltratiemateriaalstroom is ongeveer 20-50 LMH, en de ultrafiltratiemateriaalstroom is ongeveer 15-30 LMH. Vergeleken met traditionele verwerkingsmethoden kan deze aanpak efficiënt voldoen aan de procesvereisten voor zowel klaring als ultrafiltratie.

Referenties:

Saavedra et al.,Schaalbare zuivering van bacteriofaagpreparaten (2025)

Lapras et al.,Rationalisatie van het zuiveringsproces voor een faagactief farmaceutisch ingrediënt (2024)