Literatuur delen|Afscheid nemen van complexe zuivering? Een nieuwe TFF + oppervlakteactieve methode verbetert de efficiëntie en verlaagt de kosten in AAV vectorproductie

Gentherapie ontwikkelt zich snel, maar de hoge kosten blijven een grote barrière die een bredere toegang tot de patiënt verhindert. Een van de belangrijkste stuurprogramma's van deze kosten is het complexe productieproces van Adeno - geassocieerd virus (AAV) vectoren. Een studie gepubliceerd in biotechnologie en bio -engineering heeft een nieuwe zuiveringsmethode ontwikkeld die tangentiële stroomfiltratie (TFF) combineert met oppervlakteactieve stoffen, die belooft het AAV -zuiveringsproces te vereenvoudigen en de kosten te verlagen. Laten we duiken in dit onderzoek onder leiding van een team van de Universiteit van Tokyo.

 

1. Onderzoeksachtergrond: uitdagingen en huidige status van AAV -zuivering

AAV -vectoren zijn "ster" -tools geworden in gentherapie vanwege hun hoge veiligheid, lage immunogeniciteit, vermogen om zowel delende als niet -- scheidingscellen te infecteren, en capaciteit voor lange - term genexpressie. Hun productieproces is echter complex, met name de stroomafwaartse zuiveringsstappen, die meestal meerdere rondes van centrifugatie en chromatografie omvatten. Deze methoden zijn tijd - consumeren, arbeid - intensief, moeilijk te schalen en kostbaar.

Op laboratoriumschaal is zuivering vaak afhankelijk van cesiumchloride of jodixanol dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie, die een uitdaging is om te schalen voor industriële productie. Affiniteitschromatografie wordt in toenemende mate gebruikt, maar de lage pH -elutie -omstandigheden die het vereist, kunnen de virale infectiviteit aantasten. Daarom is het van cruciaal belang om een ​​eenvoudige, efficiënte, zachte en schaalbare AAV -zuiveringsmethode te ontwikkelen.

Tangentiële stroomfiltratie (tff) is een maat - gebaseerde scheidingstechniek die vaak wordt gebruikt voor het concentreren en buffer - die bioproducts uitwisselt. Conventionele TFF heeft echter een beperkt vermogen om onzuiverheden zoals gastheercelproteïnen (HCP's) en DNA tijdens AAV -zuivering te verwijderen, waardoor eiwitaggregaten vaak achterblijven.

 

2. Innovatieve aanpak: TFF gecombineerd met oppervlakteactieve stoffen voor efficiënte zuivering

To overcome the limitations of traditional TFF, researchers Rimi Miyaoka, Yuji Tsunekawa, and colleagues at the University of Tokyo devised a clever strategy: using surfactants to inhibit aggregation and interaction of impurity proteins, allowing them to pass through the TFF ultrafiltration membrane (500 kDa molecular weight cutoff) while retaining AAV viral particles (~25 nm in grootte).

Ze testten drie soorten oppervlakteactieve stoffen:

• Non - ionic:Octyl glucoside
• Anionic:Natriumdeoxycholaat
• Zwitterionic:Chaps

Uit de studie bleek dat het gebruik van een niet -ionen van een niet -ionische oppervlakteactieve stof alleen niet effectief was. Zowel het anionische natriumdeoxycholaat als zwitterionische chaps verbeterden de verwijdering van resterende eiwitten aanzienlijk en richtten zich op verschillende eiwitpopulaties. Uiteindelijk produceerde het combineren van 0,5% natriumdeoxycholaat met 1% chaps op opmerkelijke resultaten, waardoor resterende gastheer -eiwitten bijna volledig worden geëlimineerd. SDS - Pagina -analyse toonde alleen de drie Clear AAV Capsid -eiwitbanden (VP1/VP2/VP3).

 

Figuur 1. TFF -zuiveringsproces zonder oppervlakteactieve stoffen;(a) SDS - Page gel elektroforesis; (b) Transmissie -elektronenmicroscopie (TEM)

 

Figuur 1. TFF -zuiveringsproces met oppervlakteactieve stoffen;(a) SDS - PAGE GEL -elektroforese; (b) Transmissie -elektronenmicroscopie (TEM)

 

3. Onderzoeksresultaten: hoge zuiverheid, activiteit en veiligheid

1. Efficiënte onzuiverheidsverwijdering:De nieuwe methode behaalde 99,98% verwijdering van HCP's en 95% verwijdering van DNA, met zuiverheid vergelijkbaar met of overschrijden van die van affiniteitchromatografie.
2. Verbeterde infectiviteit:In vitro -experimenten toonden aan dat AAV1 -vectoren zuiverden met behulp van deze methode geïnfecteerde HEK293 -cellen efficiënter dan die gezuiverd door affiniteitchromatografie (24,9% versus 20,8%), hetgeen een beter behoud van virale bioactiviteit aangeeft.
3. Goede in vivo veiligheid:Na de lokale injectie van gezuiverde AAV1 -vectoren in skeletspier van muizen, werd na twee weken geen significante ontsteking of weefselschade waargenomen, wat goed aantoont in vivo veiligheid.
4. Brede serotype -toepasbaarheid:De methode zuiverde met succes meerdere serotypes -, waaronder AAV1, AAV5, AAV8 en AAV9-van Cell Culture Supernatants. Voor AAV2, die voornamelijk bestaat in cellysaten met hoge onzuiverheidsbelasting, is verdere optimalisatie nodig.

 

4. Samenvatting en vooruitzichten

Deze studie ontwikkelde een eenvoudig, snel (1,5 uur), efficiënt en schaalbaar nieuw AAV -zuiveringsproces. Door natriumdeoxycholaat en chaps te combineren, ging het met succes de uitdaging aan van resterende eiwitaggregatie tijdens TFF -zuivering.

Voordelen van de methode zijn onder meer:

• Het vermijden van harde lage pH -omstandigheden, het beter behouden van virale activiteit
• Het verminderen van chromatografiestappen, het vereenvoudigen van de workflow en het besparen van tijd en kosten
• Gemakkelijk schaalbaar, geschikt voor industriële grote - schaalproductie
• Het bieden van een nieuwe strategie voor het zuiveren van andere biomacromoleculen zoals exosomen, andere virussen en recombinante antilichamen

Huidige beperkingen omvatten suboptimaal virale herstel en onvermogen om lege capsiden te scheiden van volledige virale deeltjes, wat suggereert dat het beste gebruik ervan kan zijn als een eerste - stap vangt in een multi - stapzuiveringsflow.

Concluderend biedt dit onderzoek een aantrekkelijke nieuwe optie voor stroomafwaartse AAV -vectorproductie en heeft dit potentieel om de kosten van gentherapie -geneesmiddelen aanzienlijk te verlagen, waardoor hun bredere toepassing wordt vergemakkelijkt.