Samenvatting:

Dit artikel beoordeelt twee belangrijke factoren die moeten worden overwogen in eiwitzuiveringsstrategieën: stroomafwaartse toepassingsvereisten en de biologische kenmerken van de eiwitten zelf. Het artikel benadrukt dat hoogwaardige eiwitzuivering de basis is voor de betrouwbaarheid en herhaalbaarheid van experimentele gegevens, vooral voor de productie van recombinante eiwitten. Verschillende applicatiescenario's hebben specifieke vereisten voor eiwittenzuiverheid, activiteit of endotoxinegehalte en eiwitten kunnen de zuiveringsstrategieën aanzienlijk beïnvloeden. Volgens specifieke gevallen illustreert het artikel dat unieke eiwitten aangepaste zuiveringsschema's moeten aannemen. Ten slotte werd een systematisch eiwitproductieproces voorgesteld (figuur 1), waarbij de volledige kwaliteitscontrole van de selectie van expressiesystemen, constructieontwerp tot zuiveringsoptimalisatie van het proces werd benadrukt en de evaluatie van eiwithomogeniteit en functionaliteit door biofysische technieken (zoals SEC-MALS, DSF, enz.) Aanbeveling. Dit artikel is bedoeld om praktische richtlijnen te bieden voor onderzoekers, waardoor ze efficiënte en herhaalbare zuiveringsstrategieën kunnen formuleren op basis van de kenmerken en toepassingsvereisten van doel -eiwitten, waardoor de kwaliteit en efficiëntie van wetenschappelijk onderzoek wordt verbeterd.

 

Figuur 1. Schematisch diagram van het eiwitproductieproces

 

Hoge -aanvraagde eiwitproductie - Voorbeelden van probleemidentificatie, mitigatiestrategieontwerp en overeenkomstige output

 

1. Nucleïnezuurbinding aan eiwitten:

Bij het zuiveren van nucleïnezuurbindende eiwitten zijn meerdere stappen vereist om nucleïnezuurverontreiniging te verwijderen. Tijdens lysis moeten nucleasen (zoals SM Nuclease (Benzonase®) of DNase of RNase) worden toegevoegd, maar de gebonden nucleïnezuren kunnen niet volledig worden verwijderd. Vervang de verwijderingsstappen van nucleïnezuur, zoals PEI of streptomycinesulfaatprecipitatie, heparine-zuivering of ionenuitwisselingchromatografie. De aanwezigheid van nucleïnezuren werd gevolgd door de verhouding van A26 0 nm/a28 0 nm gedurende het zuiveringsproces. Als de verhouding lager was dan 0,6, gaf dit aan dat de eiwitzuiverheid relatief hoog was en dat de nucleïnezuurbesmetting minimaal was. Voor eiwitten met sterk gebonden nucleïnezuren kunnen ze tijdelijk worden gedenatureerd (zoals behandeld met ureum) en vervolgens hernieuwd worden. Belangrijkste punten: gebruik hoogwaardige reagentia, verse buffers en schone kolommen (schoon met 0,5 m NaOH voor gebruik).

 

2. Muis ferritine zware keten:

Het doel van het produceren van gezuiverde muis ferritine zware keten (MFTH1) eiwit is cryo-elektronenmicroscopie met hoge resolutie met één deeltjes (cryo-EM). De Escherichia coli -expressievector gecodeerde niet -gelabelde MFTH1 werd ultrasoon verstoord zonder een nuclease toe te voegen. Na het verwarmen op 7 0 graad, onderging het ammoniumsulfaatprecipitatie, dialyse en grootteverloceringchromatografische stappen. Het resulterende monster toonde de aanwezigheid van een grote hoeveelheid verontreinigingen in cryo-elektronenmicroscopiebeelden (figuur 2A), die volledig ongeschikt was voor de toepassing ervan. Optimaliseer de stappen. Voeg SM -nuclease toe tijdens het cellyseproces en het dialyseproces na ammoniumsulfaatprecipitatie en voeg vervolgens de anionuitwisselingschromatografiestap toe om de verhouding van A26 0 nm/A280NM van 1,4 tot 0,8 te verminderen. Na grootte -uitsluitingchromatografie was de verhouding van A260 Nm/A280 Nm van het uiteindelijke MFTH1 -monster 0,56. De SDS-PAGE en Cryo-elektronenmicroscopiebeelden (Figuur 2B) toonden aan dat het eiwit zeer puur was, wat aangeeft dat de verontreinigingen effectief waren verwijderd.

Figuur 2 muis ferritine zware ketting

 

 

 

3. Chimeer eiwit humaan DSRBEC (DSRBD-EGF-chimera):

DSRBEC wordt gevormd door de fusie van het dubbelstrengige RNA-bindende domein (DSRBD) van humaan eiwitkinase R en menselijke epidermale groeifactor (HEGF). Wanneer DSRBD tot expressie wordt gebracht in Escherichia coli, vertoont dit een extreem hoge dsRNA -bindingsvermogen. Na cellysis zal het Contaminent RNA de binding van recombinante eiwitten aan de kolom Fixed Metal Ion Affinity Affinity Chromatography (IMAC) belemmeren. Conventionele methoden zoals PEI of streptomycinesulfaatprecipitatie, RNase-behandeling of hoogzout bufferoplossingen kunnen RNA niet verwijderen. Cellysis werd uitgevoerd met behulp van een buffer die 4M ureum bevatte. Het supernatant werd op een iMAC -kolom geladen en 4m tot 0 m ureum werd langzaam 's nachts gebruikt (kolomneratie). De renaturatiebuffer werd toegevoegd met imidazol en geëlueerd uit de IMAC -kolom. De uiteindelijke verfijning werd uitgevoerd via SuperDex 75 gelfiltratie om functioneel actieve DSRBEC te verkrijgen.

 

4. Eiwitten gebonden aan tweewaardige kationen of andere cofactoren:

Voor eiwitten die interageren met divalente kationen zoals Zn 2+, Fe 2+, Cu 2+ of andere cofactors, is het cruciaal om specifieke divalente kationen (of andere cofactoren) toe te voegen tijdens expressie. Een kleine hoeveelheid van dezelfde divalente kationen (of andere cofactoren) is ook vereist tijdens het zuiveringsproces. Het gebruik van chelerende middelen (zoals EDTA, EGTA) en chelerende reducerende middelen (zoals DTT of DTE) moet echter worden vermeden. Bij het omgaan met eiwitten die gebonden zijn aan divalente kationen, moet een mengsel van proteaseremmers zonder chelerende middelen worden gebruikt om de werkelijke aanwezigheid van divalente kationen (of andere cofactoren) in het gezuiverde eiwit te bevestigen door spectroscopische methoden (zoals atoomabsorptiespectrofotometrie).

 

5. Recombinant ferridoxine (RFD) met een enkele [2FE ± 2S] cluster van thermofiele cyanobacteriën mastigocladus laminosus

Ferridoxine is een oplosbaar ijzer-sulfur-eiwit dat deelneemt aan elektronenoverdrachtreacties. Plant-type ferroredoxine draagt ​​een enkel [2FE ± 2S] -cluster als een elektronenacceptor van fotosysteem I. De Escherichia coli BL21 (DE3) stam bracht het recombinante RFD-eiwit tot expressie in het TB-medium dat 10 mm FECL3 en antibiotica bevat. Elutie van de iMac Capture -kolom werd uitgevoerd met behulp van een buffer met 10 mm histidine om imidazol te voorkomen en de vernietiging van het [2FE ± 2S] cluster te voorkomen. Anionenuitwisseling en grootte -uitsluitingchromatografie werden gebruikt voor verdere zuivering en concentratie tot 12 mg/ml voor kristallisatie -screening. Vergeleken met de recombinantproductie van ferroredoxine, bereikte het natuurlijke ferroredoxine gezuiverd uit de blauwgroene algen mastigocladus laminosus een hogere resolutie tijdens kristallisatie.

 

6. Eiwitten die worden gebruikt als antigenen

Eiwitten worden vaak gebruikt als antigenen om doelspecifieke liganden te herstellen. Het eerste wat u moet overwegen is of het eiwit wordt gebruikt voor in vivo immuniteit om conventionele monoklonale of polyklonale IgG te verkrijgen, of voor programma's met Camel IgG of in vitro selectieprocessen.

 

6.1 Antigenen die worden gebruikt voor routinematige antilichaamproductie

Wanneer antigenen worden gebruikt om monoklonale IgG -antilichamen te produceren, is het juiste vouw van het antigeen meestal niet nodig, omdat de meeste monoklonale antilichamen lineaire epitopen herkennen die niet sterk worden beïnvloed door de structuur van het antigeen, en zelfs gedenatureerde antigenen (zoals inclusie -lichaamseiwitten) blijven effectief. De zuiverheid moet echter strikt worden gecontroleerd om sterke immunogene verontreinigingen te voorkomen die de immuunrespons verstoren en de dominantie van niet-doelantilichamen veroorzaken.

 

6.2 Screening van de geconjugeerde bibliotheek

Speciale aandacht moet worden besteed aan het handhaven van de natuurlijke conformatie van het antigeen tijdens de verwerking van de nanobodiebibliotheek verkregen door kameelimunisatie. In tegenstelling tot conventionele antilichamen, herkennen kameelantilichamen (met name nanobodieën) de neiging structurele epitopen te herkennen, die gerelateerd zijn aan hun unieke convexe complementaire site -structuur. Evenzo moet het antigeen bij het screenen van grote synthetische of natuurlijke antilichaambibliotheken een structuur behouden die volledig consistent is met de doeltoepassing. Aangezien het screeningproces zelf niet-bevooroordeeld is, kan een groot aantal conjugaten die zich richten op niet-natuurlijke epitopen die zich richten op niet-natuurlijke epitopen, als het antigeen verkeerd is opgevouwen, aggregatie of conformationele heterogeniteit.

 

 

 

7. Eiwitten die intermoleculaire of intramoleculaire disulfidebindingen of vrije cysteïne bevatten

Disulfidebindingen zijn cruciaal voor het stabiliseren van de natuurlijke structuur van eiwitten. Tijdens het zuiveringsproces, bij het zuiveren van eiwitten die intermoleculaire of intramoleculaire disulfidebindingen bevatten, is het noodzakelijk om te voorkomen dat reducerende middelen worden toegevoegd om conformationele veranderingen van de eiwitten te voorkomen, waardoor hun functies worden gewijzigd. Voor eiwitten die vrij cysteïne bevatten, zijn reducerende middelen onmisbaar in alle stappen van het zuiveringsproces, vooral tijdens opslag, om de vorming van kunstmatige disulfidebindingen te voorkomen. De meest gebruikte reducerende middelen zijn dithiothreitol (dtt), -mercaptoeethanol (-me) en tris ({2- carboxyethyl) fosfinehydrochloride (TCEP). Voor IMAC -harsen die niet compatibel zijn met DTT of TCEP, wordt het aanbevolen om -ME te gebruiken en te vervangen door andere reductiemiddelen in volgende stappen.

 

8. Recombinant antilichaamfragment

Hoewel de structuur van recombinante antilichaamfragmenten (zoals nanobodieën) eenvoudiger is dan die van IgG, hangt hun functie af van de juiste vorming van disulfidebindingen. In bacteriële expressiesystemen kunnen, zelfs met de goedkeuring van optimalisatiestrategieën, er nog steeds verkeerd gevouwen of gedeeltelijk gevouwen producten optreden, die zowel in het oplosbare deel als in het inclusielichaam bestaan. Meer verborgen is dat zelfs correct gevouwen antilichaamfragmenten oplosbare aggregaten (colloïde aggregatie) kunnen vormen door hydrofobe plaques op het oppervlak. Dergelijke aggregaten zijn moeilijk te identificeren in routinematige functionele tests (zoals ELISA) omdat multivalente binding de afname van monomeeraffiniteit kan maskeren, maar hun aanwezigheid kan de toepassingen die afhankelijk zijn van kleine molecuulgrootte ernstig beïnvloeden (zoals superresolutiemicroscopie). Daarom is alleen vertrouwen op SDS-PAGE onvoldoende om de steekproefkwaliteit te evalueren. Biofysische methoden zoals gelfiltratie (figuur 3) moeten worden aangenomen om monomeren (hoofdpieken) te onderscheiden van aggregaten (uitsluitingsvolumepieken). Belangrijkste controlepunten zijn onder meer: ​​het optimaliseren van de redoxomgeving tijdens de expressie om de vorming van disulfidebindingen te bevorderen en opslagomstandigheden na zuivering te optimaliseren om aggregatie te voorkomen. Deze maatregelen zijn cruciaal om de monodispersiteit en de functie van de antilichaamfragmenten te waarborgen.

Figuur 3. GEL -filtratiescheiding van oplosbare aggregaten van nanobodies

 

9. Oplosbare fragmenten van lymfocytenreceptor LLT1

Recombinante expressie van disulfidebindingsafhankelijke eiwitten (zoals lymfocytenreceptor LLT1) wordt vaak geconfronteerd met vouwproblemen. Gelfiltratie van wildtype LLT1 vertoonde aggregatiepieken en dimeerpieken (figuur 4A), maar massaspectrometrie onthulde misfolding veroorzaakt door ongepaard cysteïne in het dimeer (Figuur 4B). Voor dit doel zijn twee mutanten ontworpen: één verwijderde het probleemcysteïne, wat resulteerde in een plotselinge daling van de opbrengst (figuur 4A); Na de introductie van neocysteïne om de conforme disulfidebinding te reconstrueren, had de mutant niet alleen een hoge opbrengst en een goede stabiliteit, maar kon ook kristalliseren (figuur 4C), en de 3D -structuur bevestigde dat de mutant de juiste disulfidebinding vormde en het natuurlijke vouw had gehandhaafd. Deze case toont aan dat door rationeel het ontwerpen van conforme disulfidebindingen, gecombineerd met gelfiltratie en massaspectrometrieanalyse, het vouwprobleem van recombinante eiwitten effectief kan worden opgelost en functionele eiwitten met stabiele structuren en hoge opbrengsten kunnen worden verkregen.

Figuur 4. Disulfidebindingsreconstructie verbetert de vouw en opbrengst van oplosbare LLT1

 

 

 

10. Eenvoudig geaggregeerde eiwitten

De zuivering van recombinante eiwitten wordt vaak geconfronteerd met het probleem van aggregatie, en de vorming ervan volgt het "nucleatie-groei" -mechanisme-een kleine hoeveelheid oplosbare aggregaten vormt eerst en activeer vervolgens grootschalige onoplosbare aggregatie. Om deze uitdaging aan te gaan, moeten strategieën op meerdere niveaus worden aangenomen: in de expressiefase kan dit worden bereikt door de stam te optimaliseren, de kweektemperatuur te verminderen, met behulp van gemodificeerde kweekmedia of verschillende oplosbare fusie-eiwitten en vervanging van expressiesystemen (insecten/zoogdiercellen), enz. Tijdens de zuiveringsfase (in een 4 graad) (in een 4 graad) (in een 4 graad) is een snelle concentratie van de proteïne) (in een snelle verbinding van de purificatie (in een 4 graad). IMac to Sec) moet worden aangenomen om geaggregeerde kernen onmiddellijk te verwijderen. Over het algemeen moeten bij de screening bufferoplossingen factoren zoals componentsamenstelling, pH -waarde, dissociatagent of oplosmiddel in aanmerking worden genomen (figuur 5). Door een fijne optimalisatie van orthogonale detectie (zoals SEC, CD, LS, DSF en temperatuurverschuiving op basis van fluorescentieverwarming, enz.), Worden de eiwitkwaliteit en de meest geschikte bufferoplossing bepaald.

Figuur 5. Strategieën voor het verlichten van eiwitaggregatie

 

11. Kristallisatie van menselijke CLK1 -kinase (hoe reproduceerbare batches te verkrijgen)

Om homogene niet-gefosforyleerde CLK1-kinase voor kristallisatiestudies te verkrijgen, werd een samenwerkingsschema met meerdere strategieën aangenomen. Ten eerste werd het samen geëxpressie met λ -fosfatase in Escherichia coli om de heterogeniteit van autofosforylering te elimineren. Hoewel de opbrengst werd verminderd, werd volledige defosforylering gewaarborgd. Na het vangen door iMac werd het eluent aangevuld met stabilisatoren (50 mm arginine, 50 mm glutaminezuur en 10 mm DTT) om aggregatie te voorkomen, geconcentreerd, en het zijn tag werd verwijderd door TEV -digestie. Vervolgens werd de juiste oligomeer gescheiden door SEC (met 5% glycerol en -ME). De uiteindelijke cruciale anionuitwisselingsstap maakt onderscheid tussen kristallijn (niet-gefosforyleerd) en niet-kristallijne (gedeeltelijk gefosforyleerde) Clk1-groepen. Het is met name vermeldenswaard dat de modus van cellysis de eiwitstabiliteit aanzienlijk beïnvloedt-de hoge druk- en hoge-temperatuurmethode leidt tot onomkeerbare aggregatie van CLK1, wat het belang van een milde behandeling voor kinase-bereiding benadrukt.

 

 

 

12. Produceer Galectin -1 met stabiele ligand-bindend vermogen

Om functionele Galectin -1 voor te bereiden voor ligandbindende studies, werden de expressie- en zuiveringsstrategieën van vier constructen (niet-gelabeld en His-gelabelde wildtype Galectin -1, niet-gelabeld en hem-gelabelde cysteine-mutant Galectin {6}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}}), niet vergeleken. Belangrijkste bevindingen geven aan dat lactose -affiniteitchromatografie -zuivering effectief kan screenen op correct gevouwen eiwitten, maar het moet worden gecombineerd met grondige dialysis (HEPES -buffer) om lactose volledig uit de bindingsplaats volledig te verwijderen en CRD -activiteit te herstellen. Wildtype Galectin -1 is vatbaar voor oxidatie en inactivering, en de stabiliteit ervan blijft beperkt, zelfs in aanwezigheid van reducerende middelen (figuur 6). De cysteïne-vrije mutant verhoogt echter de langetermijnstabiliteit aanzienlijk met behoud van vergelijkbare agglutinatieactiviteit en thermische stabiliteit (geverifieerd door nanodsf, ITC, enz.) Door de afhankelijkheid van disulfidebindingen te elimineren.

Figuur 6. De hydrodynamische karakterisering van recombinant galectine -1 onthult zijn instabiliteit

 

13. Verwijdering van endotoxine

De endotoxine-verwijderingsmethode is gebaseerd op affiniteitchromatografie, waaronder positief geladen chromatografie (anionuitwisseling), het gebruik van polycationische liganden (zoals poly-L-l-lysine (PLL), geïmmobiliseerde polyamine (polymyxine B)), en de toevoeging van de oppervlakte-triton x {2}}}. Let tijdens het zuiveringsproces aandacht aan het bereiden van de bufferoplossing met LPS-vrij water en gebruik nieuwe kolommen of kolommen die alleen zijn gebruikt in andere LPS-vrije zuiveringen. Voor endotoxineverontreiniging kan het chromatografische pomp/vloeistofsysteem 's nachts worden geïncubeerd in 0. 5m NaOH of gedurende 4 uur in 1. 0 m NaOH. De uiteindelijke hoeveelheid LPS in het monster werd geëvalueerd met behulp van Limulus Amebocyte Lysate -reagens (LAL), en het werd geverifieerd of deze onder de limiet was die nodig was voor de specifieke toepassing.

 

14. Eiwitcomplex

De expressie en zuivering van eiwitcomplexen moet worden geoptimaliseerd volgens specifieke omstandigheden. Uitdagingen zijn onder meer de instabiliteit of misfolding van subeenheden. Elke subeenheid kan onafhankelijk tot expressie worden gebracht en in vitro worden geassembleerd of samen tot expressie worden gebracht om functionele eiwitcomplexen te vormen. Het constructieontwerp moet zorgvuldig worden geïntroduceerd met zuivering- of detectielabels om te voorkomen dat u zich verstoort met de montage, vooral wanneer de complexe informatie beperkt is en meerdere optimalisaties vereist zijn. Tijdens het zuiveringsproces moet de integriteit en stabiliteit van het complex worden geëvalueerd. De methoden omvatten SDS-PAGE (subeenheid detectie), SEC (homogeniteit), SEC-MALS (molaire massa-analyse), massafotometrie of natuurlijke massaspectrometrie (massaverificatie). Opgemerkt moet worden dat het complex bij lage concentraties kan dissociëren. Op dit moment moet de chromatografische methode of buffer (zoals via thermische drift of DSF -screeningomstandigheden) worden geoptimaliseerd. Bovendien kan het verminderen van de zuiveringsstappen het verlies van zwakke interactie -subeenheden voorkomen en de zuiveringsefficiëntie en de integriteit van het complex in evenwicht brengen.

 

 

 

15. Zuivering van antigeen-antilichaamcomplexen

Antilichaam-antigeencomplexen zijn typische voorbeelden van eiwitcomplexen. Hun co-kristallisatie kan bindingspatronen onthullen en de optimalisatie van antilichaamtechniek begeleiden. Traditionele methoden vereisen een afzonderlijke zuivering van antigenen en antilichamen en mengen ze vervolgens. Recente studies hebben echter aangetoond dat co-expressie en co-zuiveringsstrategieën efficiënter zijn. Slechts een enkele zuivering is nodig om het complex te verkrijgen, en tegelijkertijd kunnen onstabiele antigenen worden gestabiliseerd door antilichamen, en zelfs labelvrije expressie kan worden bereikt. In deze specifieke situatie zijn SDS-PAGE en gelfiltratie (SEC) meestal voldoende om de zuiverheid en kwaliteit van het complex te evalueren.

 

Samenvatting

Eiwitzuivering is een fundamentele technologie in wetenschappelijk onderzoek. Academisch-schaal eiwitproductie volgt meestal op standaardstrategieën en kan oplosbare eiwitten op milligramniveau produceren, die veel worden gebruikt in structurele biologie, biochemie en functioneel onderzoek. De speciale vereisten van stroomafwaartse toepassingen (zoals de behoefte aan geen endotoxine in dierlijke experimenten en geen nuclease -besmetting in nucleïnezuuronderzoek) of de inherente kenmerken van eiwitten (zoals gemakkelijke aggregatie, die disulfidebindingen of hoge nucleïnezuuraffiniteit) vaak op maat gemaakte oplossingen vereisen. Deze beoordeling stelt, in reactie op deze speciale omstandigheden, geraffineerde strategieën voor, variërend van de selectie van expressiesystemen, het ontwerp van constructen (labels en domeingrenzen optimaliseren) tot het zuiveringsproces en introduceert kwaliteitscontrole (zoals SEC, SDS-PAGE, activiteitsdetectie, enz.) Bij belangrijke stappen. Sommige toepassingen vereisen ook aanvullende analyse (zoals endotoxinedetectie en bepaling van nucleïnezuurresidu), vergelijkbaar met het concept "kwaliteitsborging" (QA) in de biofarmaceutische industrie, dat wil zeggen defecten door systematische processen te voorkomen. Door de richtlijnen voor kwaliteitscontrole te formuleren en specifieke normen te verduidelijken voor eiwitreagentia die in wetenschappelijk onderzoek worden gebruikt, is het doel om rigoureuzere eiwitzuiveringsnormen voor academische laboratoria vast te stellen, de betrouwbaarheid en herhaalbaarheid van experimentele gegevens te verbeteren en de kloof tussen basisonderzoek en industriële normen te overbruggen.

 

Doi: 10.1186/s 12934-022-01778-5