Technologie voor inactivatie en virusverwijdering van bloedproducten
Bloedproducten zijn "plasma-eiwitcomponenten of bloedcelcomponenten, zoals menselijk bloedalbumine, menselijk immunoglobuline, menselijke stollingsfactor (natuurlijk of recombinant), rode bloedcellenconcentraat, enz., gescheiden van gezond menselijk plasma of specifiek immuun menselijk plasma, gezuiverd of gemaakt met behulp van recombinant-DNA-technologie, voor diagnose, therapie of passieve immunoprofylaxe". Bloedproducten spelen een belangrijke rol bij medische noodsituaties, het redden van oorlogsgewonden en de preventie en behandeling van een aantal specifieke ziekten.
Regelgevende achtergrond
Veiligheidspraktijken moeten ervoor zorgen dat het uiteindelijke medicijn veilig is voor toezichthouders en uiteindelijk voor patiënten en het publiek. In de jaren negentig publiceerde de Internationale Coördinatieconferentie (ICH 1998) "Q5A: Viral Safety Assessment of Biotechnological products of Human or Animal Origin Celllines" (Q5A: Viral Safety Assessment), waarmee een wereldwijde standaard voor virale veiligheid werd vastgesteld.
ICH Q5A beschrijft een meerlagig schema voor het testen en clearen van validatie om dit doel te bereiken. Het testprogramma richt zich op het oogsten van celbanken, grondstoffen en bioreactoren, aangevuld met productrisicoanalyses. Naast testen vereist ICH Q5A dat stroomafwaartse decontaminatie wordt geëvalueerd als een faalveilige maatregel wanneer er stroomopwaarts geen verontreinigingen worden gedetecteerd. Controle op goedkeuring zorgt ervoor dat als een virus het testregime omzeilt, het kan worden verwijderd en/of geïnactiveerd voordat het in het uiteindelijke geneesmiddel terechtkomt.
Achtergrondinformatie over het algemene virusbeveiligingsprogramma
Bij de moderne biotechnologische productie (of bioverwerking) zijn er gewoonlijk drie of vier eenheidsbewerkingen in de gehele gezuiverde reeks, die in staat zijn het virus te verwijderen of te inactiveren. Dit omvat bepaalde chromatografische stappen (zoals proteïne A- of anionenuitwisseling), het kweken van lage pH- of detergentia en virusretentiefilters. Niet al deze stappen zullen alle virussen effectief verwijderen of inactiveren.
Een cultuur met een lage pH is bijvoorbeeld meestal niet effectief voor de inactivatie van niet-omhulde virussen, maar werkt goed voor de inactivatie van omhulde virussen. Onder bepaalde bedrijfsomstandigheden is de anionenuitwisselingskolom mogelijk niet in staat neutrale iso-elektrische virussen uit de productstroom te binden en te verwijderen, maar hij is wel effectief tegen zure virussen.
Het is een combinatie van drie tot vier onafhankelijke en orthogonale eenheidsoperaties die samen de virusveiligheid van biotechnologische producten garanderen.
Algemeen wordt aangenomen dat een robuuste, efficiënte en betrouwbare verwerkingsstap in staat zal zijn een groot aantal virussen te verwijderen of te inactiveren (doorgaans gedefinieerd als 4 log10 of hoger, waarbij de logreductiewaarde of LRV wordt berekend als de log10 van het totaal). aantal virussen in de invoer gedeeld door het totale aantal virussen in de uitvoer). De LRV kan echter niet worden gebruikt als enige absolute maatstaf voor de effectiviteit van een stap. De gegevens kunnen voorlopig zijn. Het is gemakkelijk te modelleren, relatief ongevoelig voor veranderingen in procesomstandigheden en effectief tegen een reeks virussen (WHO 2004).
Virale filtratie wordt algemeen erkend als een krachtige en effectieve processtap en is een belangrijk onderdeel van de algemene strategie om het risico op exogene en endogene virusdeeltjes tijdens de productie van biotechnologieproducten te minimaliseren.
Virale filters werken vaak via sterke, op grootte gebaseerde retentiemechanismen. Op basis van dit krachtige werkingsmechanisme is het waarschijnlijker dat virusfilters dan chromatografische stappen voorspelbare virale retentie voor een reeks virussen bieden. Dit komt omdat het minder waarschijnlijk is dat het filter wordt beïnvloed door verschillen in de fysisch-chemische eigenschappen van verschillende virussen en virus-hars-interacties die worden gereguleerd door de bedrijfsomstandigheden. Daarom wordt de virale filtratiestap vaak gebruikt in goed ontworpen recombinante therapeutische eiwitzuiveringsprocessen (EMEA 1996), waarvan ook is aangetoond dat ze robuuste prestaties leveren in de plasmaverwerkende industrie.
Bloedproducten zijn echter als een tweesnijdend zwaard, dat niet alleen duizenden levens redt, maar ook de mogelijkheid biedt ziekten te verspreiden en een bedreiging voor de menselijke gezondheid te vormen. Volgens statistieken ontvingen tussen 1977 en 1984 minstens 30000 bloedontvangers in de Verenigde Staten bloed dat besmet was met het AIDS-virus. In 1985 raakten 1200 van de 3000 hemofiliepatiënten in Frankrijk besmet met AIDS via bloedtransfusies of bloedproducten.
Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie wordt wereldwijd 5 tot 10% van de AIDS-infecties veroorzaakt door transfusies van met AIDS geïnfecteerd bloed of bloedproducten. Het eerste geval van AIDS in China werd besmet door het gebruik van geïmporteerde bloedproducten die besmet waren met het AIDS-virus. Daarnaast is ook melding gemaakt van de overdracht van hepatitis B- en C-ziekten als gevolg van transfusie van bloed en bloedproducten.
1. Belangrijkste virussen die worden overgedragen door bloedproducten en hun kenmerken
Er zijn veel soorten virussen die via bloed en bloedproducten worden overgedragen, zoals weergegeven in Tabel 1. Onder hen zijn HIV, HBV en HCV bezorgd in binnen- en buitenlandse medische kringen vanwege hun hoge infectiepercentage en ernstige schade.
Omdat bloed en bloedproducten de mogelijkheid hebben om virussen te verspreiden, heeft dit de toepassing ervan bij de preventie en behandeling van ziekten ernstig aangetast. Daarom moeten bij de productie van bloedproducten virusinactivatie- en -verwijderingsprocessen worden toegevoegd om de veiligheid van bloedproducten te garanderen.
2. Belangrijkste methoden voor inactivatie en verwijdering van virussen
Om de veiligheid van bloedproducten te garanderen, is, naast de selectie van bloeddonoren, immunisatie waar mogelijk, en het strikt testen van verzameld bloed en andere maatregelen, de inactivatie en verwijdering van de virusbehandeling van bloedproducten een belangrijke schakel om de veiligheid van bloedproducten te garanderen. veiligheid van bloedtransfusies. Verschillende veelgebruikte en effectieve methoden voor het inactiveren en verwijderen van virussen worden hieronder in detail beschreven.
I. Methoden voor virusinactivatie
1. Pasteurmethode
De theoretische basis van deze methode is dat de vernietigingssnelheid van de virusstructuur veel hoger is dan die van de eiwitstructuur door de selectie van temperatuur en actietijd. Bijna 50 jaar klinische gebruiksresultaten en recente dierproeven hebben bevestigd dat albumine in oplossing na een verwarmingsbehandeling van 60 graden en 10 uur, dat wil zeggen Pasteur-desinfectie, niet alleen HBV kan inactiveren, maar ook HCV en HIV kan inactiveren, waardoor albumine het meest betrouwbaar is. bloedproduct in virale veiligheid.
Onlangs is het proces van Pasteur uitgebreid naar de productie van IVIG, FVI, FIX, fibrinogeen en andere producten. Bridonnccu et al. voegde dit virusinactivatieproces toe aan het IVIG-proces voor ethanolproductie bij lage temperatuur, dat wil zeggen dat de Pasteur-methode werd geïmplementeerd onder omstandigheden zonder stabilisator, lage zout- en zuurgraad, en de virustiter daalde met 5 Log. Simmonds et al. testte transfusie-overdraagbaar virus (TTV) van geconcentreerde FVⅢ- en FIX-preparaten die klinisch worden gebruikt in het VK, en ontdekte dat het TTV-detectiepercentage van producten zonder inactivatie van het Pasteur-virus 50% tot 75% bedroeg, en het positieve detectiepercentage van producten na Pasteur-inactivatie was 0.
Het TTV-positieve percentage was 27% bij 84 hemofiliepatiënten in het Verenigd Koninkrijk die niet-geïnactiveerde stollingsfactorproducten gebruikten, terwijl slechts 1 op de 19 patiënten die door virus geïnactiveerde stollingsfactorproducten gebruikten positief was, met een positief detectiepercentage van 5%. Daarom is het virusinactivatieproces zeer effectief bij het verbeteren van de veiligheid van bloedproducten.
2. Organisch oplosmiddel gecombineerd met oppervlakteactieve stof (S/D-methode)
This method was first established by Horowitz et al., a blood center in New York, the principle is that organic solvents can make lipids fall off the surface of the virus, so that the structure of the virus is destroyed and the infection activity is lost. The common S/D method uses n-butyl triphosphate (TNBP) in combination with different surfactants such as Tine80, Triton X100, and sodium cholate. The effect of S/D method on the inactivation of lipid-coated viruses in blood products has been confirmed. For example, when FI concentrated preparations were treated with 0.3%TNBP and 0.2% sodium cholate at 24℃ for 6 h, the inactivation of HBV and HCV was >4 Log,HIV >4.5 Log, and the inactivation of VSV and Sindbis viruses was >4.5 Log, and the recovery rate of FVIII was >90%. Een groot aantal bloedproducten die via de S/D-methode zijn geïnactiveerd, zijn veilig en betrouwbaar gebleken door klinische toepassing op de lange termijn, en worden daarom op grote schaal gebruikt. Deze methode heeft echter geen inactiveringsvermogen tegen parvovirus B19, HEV en andere niet-lipo-gecoate virussen.
3. Methode voor inactivatie door droge hitte
Inactivatie door droge hitte betekent dat het gelyofiliseerde preparaat wordt behandeld door verhitting en dat het virus wordt gedood door droge hitte. Veelgebruikte droge hittemethoden zijn 60 graden ~80 graden, 10~72 uur verwarmingsmethode en 80 graden, 72 uur behandelingsmethode. Al in het begin van de jaren tachtig was het nuttig om het FVIII-gevriesdroogde geconcentreerde preparaat en het protrombinecomplex gedurende 10-72 uur te verwarmen op 60 graden ~ 80 graden. Het is echter bewezen dat deze methode HBV, HCV en HIV niet volledig kan inactiveren. Het is bewezen dat droge hittebehandeling bij 80 graden en 72 uur effectief is bij het inactiveren van HBV, HCV en HIV. Er zijn ook recente meldingen geweest van gelyofiliseerde preparaten van stollingsfactoren die bij 100 graden werden behandeld. Xu Jinbo et al. behandelden IgG gedurende 30 minuten bij 100 graden en geïnactiveerd vesiculair stomatitisvirus 8.2 Log. Sommige mensen zullen FVIII gedurende 72 uur op 68 graden invriezen, in droge toestand en vervolgens gedurende 0,5 ~ 1 uur op 100 graden verwarmen. Deze methode is relatief economisch.
4. Fotochemische methode
This method was first proposed by Matthews et al. The principle is that some photosensitizers have a strong affinity for the surface of the virus and the structure of the viral nucleic acid, and are easily activated under appropriate wavelength of light, thus destroying the structure of the virus in contact with them through photochemical action. The photosensitizers that have been used include: hemacoline derivatives, psoralide derivatives, phenothiazines, phthalocyanines, and cyanine 540, etc. The main feature of this method is that it can be used to inactivate the virus of whole plasma, and the inactivation of the virus of platelet products is the current research focus. Scientists from the Department of Experimental Medicine at the University of California in the United States have screened out a new psoralen derivative S-59 among more than 100 chemical modifications of psoralen. The platelets were irradiated with 150 um S-59 combined with 3 J/cm2 UVA, which could inactivate >6.7 Log of free HIV and >6.6 Logboek van aan HIV gebonden cellen en de bloedplaatjes bleven goed na 7 dagen functioneel behoud in vitro, wat door de FDA is goedgekeurd voor klinische onderzoeken.
Van deze methoden zijn de Pasteur-desinfectiemethode en de S/D-methode goedgekeurd door de Amerikaanse FDA en worden ze wereldwijd veel gebruikt. De droge hitte-inactivatiemethode is voornamelijk geschikt voor virusinactivatie van gelyofiliseerde preparaten. De fotochemische methode heeft een sterk inactiverend effect op met lipiden omhulde virussen, en is gebruikt bij de inactivatie van volledige plasmavirussen in Europa, en biedt brede vooruitzichten voor virusinactivatie in bloedcelcomponenten. Al deze methoden hebben echter hun eigen tekortkomingen, zo is pasteursterilisatie niet ideaal voor de inactivatie van sommige hittebestendige virussen; De S/D-methode kon het niet-lipo-gecoate virus niet effectief inactiveren. De fotochemische methode heeft de activiteit van sommige plasma-eiwitten aanzienlijk beschadigd. Uit het huidige klinische gebruik van vervolgonderzoeken blijkt dat geen enkele virusinactivatiemethode kan garanderen dat bloedproducten absoluut vrij zijn van het risico van overdracht van virussen.
I. Virusverwijderingsproces
Bij de productie van bloedproducten kan één inactivatieproces niet alle virussen inactiveren; Bovendien is het virus zelf een heteroloog eiwit, omdat de toevoeging aan het product bijwerkingen zal veroorzaken; Tegelijkertijd zijn er, vanwege de beperking van het technische niveau, nog steeds virussen waarvan de kenmerken niet worden gevonden of begrepen, zodat de bestaande virusinactiveringsmethoden het inactiverende effect van deze virussen niet kunnen garanderen. Daarom kan inactivatie alleen de veiligheid van het product niet garanderen en moet het uit het product worden verwijderd. Technologie voor het verwijderen van virussen krijgt dus steeds meer aandacht. Hieronder worden twee veelgebruikte en effectieve processen voor het verwijderen van virussen kort beschreven.
1. Chromatografische technologie
Chromatografische technologie verwijst naar het gebruik van verschillende componenten en stationaire fase-affiniteits- of interactieverschillen om de scheiding van verschillende componenten te bereiken. Als geavanceerde technologie voor de productie van bloedproducten heeft chromatografie zelf het effect dat virussen worden verwijderd, vooral affiniteitschromatografie en ionenuitwisselingschromatografie. Voor ionenuitwisselingschromatografie heeft elutie voordelen ten opzichte van penetratie bij het verwijderen van virussen. Tabel 2 toont de gegevensstatistieken van de HAV-verwijderingssnelheid door middel van chromatografische technologie tijdens het proces van albumineproductie door CSL Company in Australië. Zoals blijkt uit Tabel 2 zijn ionenuitwisselingschromatografie en gelfiltratie effectiever bij het verwijderen van HAV, met een totale verwijderingssnelheid van 10,9 Log.
Bij de productie van FVIII voert Baxter Healtheare immunoaffiniteitschromatografie uit met behulp van met anti-FVIII-antilichamen behandelde gels, die (4,2±0.1)Log en (5,3±0.9)Log kunnen verwijderen van niet -lipide-gecoate virussen zoals respectievelijk PPV en HAV.
2. Nanofilmfiltratie
Voor sommige virussen met een kleine oppervlaktediameter, zoals HAV en parvovirus B19, is nanomembraanfiltratie de meest effectieve verwijderingsmethode. Het maakt gebruik van het verschil in grootte tussen eiwitten en virussen en de adsorptie van virussen door het filtermembraan om virussen te isoleren. Bij Bloedvoorziening Sanquin in Nederland is laboratoriumonderzoek uitgevoerd naar het verwijderen van virussen door het toevoegen van een eenstaps, tweetraps Planova 15N nanomembraanfiltratie aan het protrombinecomplexproductieproces. Er werd gevonden dat de verwijderingspercentages van HIV, HAV en andere virussen in verschillende mate toenamen na nanomembraanfiltratie (zie Tabel 3).
Wanneer deze methode wordt toegepast op industriële productie kunnen zich echter de volgende problemen voordoen: Ten eerste mag, vanwege de hoge viscositeit van het product en de aanwezigheid van eiwitten met een grote diameter, de door het filter geselecteerde poriegrootte van het membraan niet te klein zijn; waardoor de verwijdering van virussen met een kleine diameter, zoals HCV, wordt beperkt; Ten tweede zal de stabiliteit van de controle van de membraanporiegrootte tijdens het filterproductieproces de verwijdering van virussen beïnvloeden. Ten derde zal, wanneer de membraanopening kleiner dan de diameter van het virusdeeltje wordt geblokkeerd, de productstroomsnelheid worden verminderd, wat de opbrengst beïnvloedt. Daarom is de selectie van membranen waarvan de eigenschappen en poriegrootte geschikt zijn voor de behoeften van de verwerkte producten een belangrijke factor bij de vraag of de nanomembraanfiltratie virussen kan verwijderen.
3. Discussie
Vanuit het uitgangspunt dat de kwaliteit van de bloedbron moet worden gewaarborgd, is het proces van inactivatie en verwijdering van virussen een belangrijk en noodzakelijk middel om de veiligheid van bloedproducten te garanderen. Het gebruik van slechts één geïnactiveerd virusproces kan de veiligheid van bloedproducten niet absoluut garanderen. Op basis van de virusinactiveringstechnologie werd de virusverwijderingstechnologie zoals chromatografie en nanofilmfiltratie toegevoegd, de virusverwijderingssnelheid aanzienlijk verhoogd en het virusinactivatie- en verwijderingseffect aanzienlijk verbeterd. Momenteel heeft Europa duidelijk voorgesteld dat er bij het productieproces van bloedproducten minstens één inactivatie en verwijdering van virussen moet plaatsvinden om de veiligheid van bloedproducten te garanderen.
In China gebruiken de meeste fabrikanten van bloedproducten slechts één geïnactiveerd virusproces in het productieproces, zoals de Pasteur-desinfectiemethode, de S/D-methode, enz., maar gebruiken ze niet het virusverwijderingsproces, wat de kwaliteit van bloedproducten ernstig aantast. Met de toetreding van China tot de WTO zullen het productieproces en de kwaliteitsnormen voor binnenlandse bloedproducten in lijn zijn met die van de wereld. Anders kan het land het bestaande binnenlandse marktaandeel niet garanderen, maar kan het ook niet concurreren met soortgelijke producten in andere landen in de wereld. internationale markt.
Daarom moeten de Chinese bloedproductenfabrikanten het productieproces verbeteren en de inactivatie en verwijdering van het virus versterken, om de kwaliteit en veiligheid van het product volledig te garanderen. Daarom zal het voor Chinese bloedproductenfabrikanten de trend zijn om chromatografie te gebruiken om bloedproducten te zuiveren en virussen te verwijderen om de veiligheid van bloedproducten te garanderen.
Over Guidling
Guidling Technology is een nationale hightech onderneming die zich richt op biofarmaceutica, celcultuur, zuivering en concentratie van biogeneeskunde, diagnose en industriële vloeistoffen. We hebben met succes centrifugale filterapparaten, ultrafiltratie- en microfiltratiecassettes, virusfilters, TFF-systemen, dieptefilters, holle vezels, enz. ontwikkeld. Die volledig voldoen aan de toepassingsscenario's van biofarmaceutica, celcultuur, enzovoort. Onze membranen en membraanfilters worden veel toegepast bij het concentreren, extraheren en scheiden van voorfiltratie, microfiltratie, ultrafiltratie en nanofiltratie. Onze vele productlijnen, van kleine laboratoriumfiltratie voor eenmalig gebruik tot productiefiltratiesystemen, steriliteitstesten, fermentatie, celcultuur en meer, voldoen aan de behoeften van testen en productie. Guidling Technology kijkt ernaar uit om met u samen te werken!
