Membraantechnologie en vaccinverduidelijking (Ⅱ)

In het vorige artikel hebben we een eerste kennismaking gehad met vaccins en strategieën voor het ophelderen van vaccins, en we zullen deze in de rest van dit artikel blijven onderzoeken. In navolging van het bovenstaande zullen we vaccinverduidelijkingen en gerelateerde membraanweefseltoepassingen blijven delen.

 

2.2.2 Invloed van fysische en chemische eigenschappen van virussen

Na het productiesysteem en de methoden om de relevante verontreinigingen in de klaringsstap te verwijderen, te hebben overwogen, is het belangrijk om rekening te houden met de kenmerken van het virus en te focussen op het maximaliseren van de virusopbrengst.

 

2.2.2.1 Gemakkelijke virusadsorptie
Positief geladen materialen en filterhulpmiddelen (zoals diatomeeënaarde) zijn ontwikkeld om de diepe filtratie-effecten te verbeteren. Hoewel de positieve lading de opname van nucleïnezuren en HCP vergroot, is het bekend dat diatomiet celresten en colloïden bindt. Deze materialen kunnen het virus echter ook vasthouden via het adsorptiemechanisme. Omdat het virus in oplossing meestal negatief geladen is, kunnen elektrostatische interacties met het positief geladen filter optreden.
Virussen kunnen zich ook binden door hun hydrofobe of niet-specifieke interacties met bepaalde filtermaterialen (zoals diatomiet of glasvezels). Omhulde virussen zijn vanwege hun lipide-omhulsel gevoeliger voor deze adsorptie. Als het virus door elektrostatische interacties aan het filter wordt geadsorbeerd en de virusdeeltjes door zoutconcurrentie worden losgemaakt, kan het spoelen van het filter met een sterk geleidende buffer het virus gedeeltelijk herstellen. Dit kan echter ook verontreinigingen zoals HCP of nucleïnezuren elueren. Daarom verdient het gebruik van een alternatief filtermateriaal, zoals het meer inerte polypropyleen, de voorkeur.
Adenovirus is easily adsorbed, but different results have been confirmed. Using positively charged diatomite and deep filters. Borosilicate glass fiber filter material is also very well recovered. On the other hand, a patent proposed by Weggeman involving clarification of 20 – 40% adenovirus losses at PER, et al. Cell cultures were prepared with similarly positively charged deep filters containing diatomite. In this case, the nominal polypropylene filter showed a very high viral recovery rate (> 90%).
Het is algemeen bekend dat influenzavirussen tijdens de klaring gevoelig zijn voor adsorptieverlies. Daarom is het gebruik van een gratis filter, het filter op basis van polypropyleen, geschikt voor het verduidelijken van de griepopvang. Thompson et al. rapporteerden het gebruik van een polypropyleenfilter met een nominaal vermogen van 1,2 μm gevolgd door een 0.45 μm PVDF-membraan om op cellen gebaseerd influenzavirus geproduceerd door MDCK-cellen op te helderen. Er zijn in totaal negen zuiveringstests uitgevoerd op de schaal van 20L, waarbij 111 l/m2 werd geladen voor een polypropyleenfilter van 1,2 μm en 105 l/m2 voor een PVDF-filter van 0,45 μm. Uit de resultaten bleek dat het merendeel van de actieve virussen goed herstelde (78-154%). Ze rapporteerden ook een verwijdering van hcDNA tot 58%, maar geen significante verwijdering van HCP.

 

2.2.2.2 Gevoelige virussen knippen

Sommige virussen (ingekapseld of niet-ingekapseld) vertonen een lage mechanische weerstand en kunnen worden vernietigd door blootstelling aan afschuifkrachten tijdens centrifugatie- en membraanfiltratiestappen. Afschuifkrachten die worden gegenereerd tijdens zuiveringsstappen waarbij filtratie of chromatografie betrokken is, kunnen ervoor zorgen dat de virale envelop eraf valt, waardoor de infectiviteit wordt beïnvloed. Afhankelijk van de grootte, dikte en geometrie van de capside kan de virale capside bros zijn of, omgekeerd, veerkrachtig tegen hoge drukken. Sommige omhulde virussen, zoals influenzavirussen, zijn elastisch tegen mechanische belasting en zijn bestand tegen grote vervormingen. Aan de andere kant kan schuifkracht ervoor zorgen dat de envelop van minder resistente virussen, zoals retrovirussen, eraf valt, waardoor de infectiviteit van het virus wordt aangetast.

Extracellulair gegenereerde envelop-VLP's zijn ook erg kwetsbaar. Bij het centrifugaalproces worden hoge afschuifsnelheden gegenereerd, voornamelijk bij de inlaat- en uitlaatdelen (hoge afschuifsnelheden worden gegenereerd op het gas-vloeistofgrensvlak). Toen het virus werd gezuiverd door gradiëntcentrifugatie, werd het transductievermogen van sommige retrovirussen aanzienlijk verzwakt. Bij het ontwerpen van centrifugale scheiding moet rekening worden gehouden met de relatieve instabiliteit van virusdeeltjes ten opzichte van schuifkrachten. Centrifugaalkracht is niet de enige bron van schuifschokken, belangrijker is het ontwerp van de apparatuur, vooral bij de import en export is er ook sprake van aanzienlijke schuifschokken. Verschillen in het ontwerp van verschillende schalen kunnen leiden tot verschillen in de opbrengst en het herstel van schuifgevoelige virussen op verschillende schalen.

Afschuifgevoelige virussen moeten zorgvuldig worden ontworpen omdat de omvang van de schuifspanning en de tijd van blootstelling aan de spanning (als gevolg van recirculatie) hoog kunnen zijn. Voor schuifgevoelige virussen wordt de voorkeur gegeven aan open-circuitapparaten (hollevezel- of openplaatapparaten) om turbulentie en schuifkrachten in het toevoerkanaal te verminderen.

De keuze van de bedrijfsparameters moet ook de schade aan de virusdeeltjes minimaliseren: lage kruisstroom, gemiddelde transmembraandruk (TMP) en korte verwerkingstijd.

Membraanbesmetting onder hoge druk leidt tot verlies van virale infectiviteit, mogelijk als gevolg van de krachten die afschuifwerking op de virale envelop kan uitoefenen. Op membraan gebaseerde scheiding is gebaseerd op grootte, en de accumulatie van virale remmers en virale deeltjes met een hoog molecuulgewicht kan de infectiviteit van virale vectoren verminderen.

De afbraak van schuifgevoelige virussen tijdens diepe filtratie is niet uitgebreid gedocumenteerd. Verlies van virussen bij diepe filtratie wordt meestal toegeschreven aan het vangen, adsorptie of tijd- en temperatuurafhankelijke virale afbraak van het product. Hoewel er mechanische spanning kan optreden in NFF-systemen, is de blootstellingstijd voor NFF-producten aan afschuiving zeer kort in vergelijking met andere technologieën vanwege de snelle enkele doorgang die wordt ervaren bij NFF-producten.

 

2.2.2.3 Onderscheppen volgens de openingsgrootte

Virussen groter dan 100 nm kunnen worden tegengehouden door mycoplasma of membranen van steriele kwaliteit (0.22 μm en lager) te verwijderen. In dit geval moet speciale aandacht worden besteed aan de selectie van filters. Voor TFF-stappen voor microfiltratie wordt de voorkeur gegeven aan membranen van 0.45μm of 0,65μm voor goede productkanalen. Voor NFF-meerstapsfiltratie is de dichtste laag groter dan of gelijk aan 0,45 μm. Wees voorzichtig bij het kiezen van een diepfilter, aangezien sommige diepfilterapparaten een filmlaag kunnen bevatten, wat kan resulteren in productverlies door retentie. Virusaggregatie heeft een negatieve invloed op de virusproductie en verbetert de virusretentie vanwege de virusgrootte.

Volgens een patent van Andre en Champluvier kan homogenisatie verstopping van het filter voorkomen of beperken door de grootte van het aggregaat te verkleinen, wat een hogere opbrengst oplevert. Homogenisatie verbeterde ook de filtratiecapaciteit van de oogst, die met een factor 2,4-3 toenam.

Te veel onzuiverheid kan het virusherstel verstoren. Onzuiverheden hebben de neiging het filter te verstoppen, en verstopte membraanporiën kunnen resulteren in een verminderde doorgangssnelheid van virussen. In een patent van de Vocht en Veenstra wordt vermeld dat de directe klaring van hoge celdichtheid Per. Verzameling met TFF({0}}.65 of 0.2 μm membraan) resulteerde in adenovirusvrij virusherstel. Herstel kan worden bereikt door selectieve precipitatieverwijdering van gastheercel-DNA voorafgaand aan de TFF-stap van 0,65 μm. 70% van de adenovirussen.

 

 

2.3 Casestudy: Optimalisatie van de opheldering van virale vaccins

Op de Internationale Conferentie over Biologische Processen van 2011 presenteerde Sanofi Pasteur een rationele benadering van het screenen van filters voor de ontwikkeling van nieuwe geklaarde sequenties voor kandidaat-virale vaccins. Het onderzoek heeft tot doel de problemen te overwinnen die zich voordoen bij het optimaliseren van cel- en viruscultuurprocessen. Aanpassingen aan het stroomopwaartse proces resulteerden in een opbrengstverlies van 20% en voortijdige filterverontreiniging tijdens de klaringsstap, wat resulteerde in geen opschaling. Om een ​​robuuste en schaalbare klaringsstap tot stand te brengen, was een volledige herontwikkeling van de filtersequentie vereist, met virale herstelpercentages van meer dan 85%.

Based on internal experience and scientific publications, the team selected 27 filters for an initial screening study. Small scale virus adsorption tests were performed on various filter media (polypropylene, nylon, cellulose ester, glass fiber, charged adsorption filter) and structures (pleated or deep filter). The virus yield was measured by ELISA and the clarifying efficiency of the preselected filtrate was compared by checking the reduction of turbidity. Preliminary screening studies showed that nylon and charged filters retained viral particles and virus recovery. Ten percent. The virus recovery rate of polypropylene and polyether sulfone filter was >. 80%. Het terugwinningspercentage van cellulose-ester- en glasvezelfilters is afhankelijk van de beoordeling van het filter (20% of 90%).

Als tweede stap evalueerde Sanofi Pasteur verschillende combinaties (fase 2- of fase 3-sequenties) van de zeven vooraf geselecteerde filters in het screeningonderzoek. De constante stroomclassificatietest werd uitgevoerd met een klein filter. Bovendien werd in dit experiment een hogere opbrengst gehanteerd dan in het screeningsonderzoek. Op basis van de resultaten van het virusherstel en de filtercapaciteit koos het team de twee beste combinaties voor verder onderzoek.

- Sequentie 1 (fase 2): 30 μm nominaal gevouwen polypropyleenvoorfilter, gevolgd door een meerlaags filter van samengestelde cellulose-ester en glasvezel (1/0,5 μm porositeit)

- Sequentie 2 (fase 3): hetzelfde voorfilter (30 μm nominaal polypropyleenfilter), gevolgd door een tussenliggend meerlaags polypropyleenfilter en tenslotte een asymmetrische polyethersulfonfilm.

 

The robustness of these two clarified sequences has been challenged by repeated constant flow sizing experiments with different harvest batches. While both potential sequences demonstrated enhanced capabilities compared to the reference sequence, only sequence 1 achieved virus recovery objectives (>85%), zoals weergegeven in Figuur 1.

Figuur 1 Gemiddeld virusherstel bij elke filterstap. Stabiliteitsstudies werden geëvalueerd voor drie filtratiesequenties, waarvan alleen sequentie 1 met behulp van een 30 μm nominaal gevouwen polypropyleen en een 1,0/0,5 μm cellulose-ester en glasvezelfilter voldeed aan de globale hersteldoelstelling .

Centrifugatie werd ook geëvalueerd als de primaire klaringsstap, gevolgd door eindfiltratie van {{0}}.45 μm. Er zijn verschillende snelheid/duurparen getest. Hoewel de filtratiesnelheid van 0,45 μm tweemaal werd verhoogd, was de uiteindelijke opbrengst lager dan de doelstelling van 85%. Als gevolg hiervan is centrifugeren niet verder onderzocht.

Ten slotte werden de prestaties van de polypropyleen- en glasvezelfiltratiesequenties op grotere schaal (bioreactorgrootte van 160 L) geëvalueerd. De filtersequentie wordt getoond in Figuur 2.

Figuur 2 Verduidelijkt de filtercombinatie en een grafische weergave van de stapopbrengst van de string. Trein A is het traditionele proces en trein B is het geoptimaliseerde proces. De geoptimaliseerde reeks B kan het voorfiltratiegebied drie keer verkleinen, de tussenliggende filtratiestap annuleren en het uiteindelijke filtratiegebied tien keer verkleinen, waardoor het wereldwijde virusherstel met 3% wordt vergroot.

Verschillende batches werden met succes geklaard zonder tekenen van filterverstopping, procestijd in lijn met productielimieten en virusopbrengst van > vijfentachtig procent. De optimalisatie van de verduidelijkingsstappen had geen effect op de vervolgstappen en de belangrijkste kwaliteitskenmerken van het vaccin. Daarom werd de geselecteerde klaringssequentie gebruikt in het vaccinproductieproces (bioreactor met een grootte van 1000 L) en werd de prestatie met succes bevestigd.

 

03 Verduidelijking van bacteriële vaccins

3.1 Overwegingen ter verduidelijking van bacteriële vaccins

Volgens de Medical Thesaurus (2015) wordt een bacterieel vaccin gedefinieerd als een suspensie van verdunde of gedode bacteriën of hun antigene derivaten die wordt gebruikt om een ​​immuunrespons op te wekken om bacteriële ziekten te voorkomen of te behandelen. Meer in het algemeen kunnen bacteriële vaccins worden onderverdeeld in vier subcategorieën op basis van het type actief antigeen. Deze makelaar kan zijn:

- Doodt of verzwakt de gehele levende bacterie. Ook bekend als het BCG-vaccin.

- Zuivering van antigene determinanten (subeenheidvaccins). Miltvuurvaccin of acellulair kinkhoestvaccin.

- Bacteriële toxinen (toxoïden). Difterie- en tetanustoxoïden.

- Plasmide (pDNA).

Vanwege de grote heterogeniteit van de producten van de familie hangen de uitdagingen in de upstream- en downstreamprocessen grotendeels af van het type vaccin dat wordt geproduceerd. Daarom kan na de initiële fermentatiestap al dan niet worden gezuiverd, zodat de klaringsstap kan worden uitgevoerd.

 

3.2 Strategie voor het ophelderen van bacteriële vaccins

3.2.1 Toxoïde

De twee meest voorkomende toxoïden die voor vaccingebruik worden geproduceerd, zijn difterie en tetanus, die respectievelijk worden geproduceerd door Corynebacterium diphtheriae en Clostridium tetani. De productie van beide vaccins is onderworpen aan strenge wettelijke eisen. Het technische rapport van de WHO en de bijlagen daarbij doen duidelijke aanbevelingen om de kwaliteit, veiligheid en doeltreffendheid van tetanus- en difterievaccins te garanderen. Algemene goede productiepraktijken zijn van toepassing op de productie van beide vaccins, en werknemers moeten goed zijn opgeleid en een boosterimmunisatie tegen beide ziekten krijgen.

GMP vereist strikt dat de zuiverheid en kwaliteit van het eindproduct moet worden aangetoond. Volgens de WHO en EP moet de werkzaamheid van een definitief tetanusvaccin worden bepaald door vergelijking in vivo of met een andere bewezen methode met een geschikte referentiestof, gekalibreerd in internationale eenheden volgens de Internationale Standaard voor tetanustoxoïd. Bijgewerkte eisen voor de werkzaamheid zijn in 2011 gepubliceerd en kunnen variëren afhankelijk van de beoordelingsmethode. De veiligheid (toxinevrije en herstellende toxiciteit) van elke batch vaccin moet ook worden aangetoond. Ten slotte moet aandacht worden besteed aan de stabiliteit van vaccins, vooral in realtime.

 

3.2.2 Plasmide-DNA-vaccin

Plasmide-DNA-vaccins worden gebruikt voor diergezondheidsdoeleinden, en verschillende plasmide-DNA-vaccins voor menselijk gebruik bevinden zich in verschillende stadia van ontwikkeling en klinische evaluatie. Na E. coli-fermentatie worden de bacteriën verzameld en gesplitst om plasmide-DNA vrij te geven.

Verwijdering van celresten wordt gewoonlijk bereikt door centrifugatie of filtratie. In recente publicaties is het onderwerp uitgebreid aan bod gekomen. In deze publicatie worden de huidige upstream-, downstream- en formulerings-pDNA-processen en -uitdagingen beschreven.

De auteurs geven ook inzicht in de hiaten bij elke stap van het typische pDNA-productieproces en potentiële toekomstige innovaties en/of huidige technologische hiaten die zouden kunnen leiden tot verdere procesoptimalisatie.

Plasmide-DNA-vaccins worden in twee stappen bereid. Eerst worden de bacteriële cellen uit het kweekmedium verwijderd en ten tweede worden de celresten na de cellyse verwijderd. Afhankelijk van de schaal worden de cellen verzameld met behulp van centrifugatie of TFF-microfiltratie. De schijfstapelcentrifuge wordt met tussenpozen met hoge snelheid uitgeworpen en de opbrengst aan supercoiled plasmiden is slecht als gevolg van schuifschade tijdens het ontladen. Als centrifugatie moet worden gebruikt, is een vaste komcentrifuge het beste. Open kanaal, platte TFF-apparaten met 0.1 of 0.2 μm microfiltratiemembranen of holle vezelapparaten kunnen goed werken.

Omdat hollevezelapparaten een hoog draagvermogen hebben, krijgen ze soms voorrang. Normaal gesproken werken deze processen bij 3-5 keer de concentratie, gevolgd door 3-5 volumes transfiltratie. Om de schuifkracht te verminderen en de membraanpolarisatie beter te controleren, worden penetratiecontroleoperaties ten zeerste aanbevolen. Hoewel centrifuges kosteneffectiever zijn bij grootschalige commerciële activiteiten, hebben kleinere processen de neiging om filtratie te gebruiken vanwege de draagbaarheid en het bedieningsgemak.

Er zijn vlokmiddelen gebruikt om de verwerking te vergemakkelijken, maar dit kan tot productverlies leiden. Sommigen raden ook aan om inerte diatomeeënaardedeeltjes te gebruiken, gevolgd door zakfiltratie.

Cell lysis produces viscous products, including large particles, cell fragments, soluble impurities, fine colloidal particles, and pDNA. Due to the complexity of the material, removing such fine solids is a difficult separation. Gradient density deep filter or open hole structure (>0.45m) membraanfilters zijn goed in het verwijderen van celresten. Vanwege de sterke verstopping van celafval verdient filtratie met een lage stroomsnelheid of lage druk de voorkeur. Voor deze stap zijn op TFF gebaseerde microfilters en zakkenfilters op industriële schaal gebruikt. Voor statisch (in een mengvat) en continu (met behulp van een in-line statische menger) kraken zijn verschillende filters nodig.

 

3.3 Casestudy: Vergelijking van de werkzaamheid van centrifugatie-, NFF- en TFF-methoden voor het zuiveren van tetanustoxinen

Muniandi et al. vergeleek drie verschillende methoden voor het zuiveren van tetanustoxinen en toxoïden uit fermentatievloeistoffen, namelijk centrifugatie, diepe filtratie (NFF) en TFF. Het testmateriaal werd geproduceerd in een fermentor van 400L met behulp van een gemodificeerd Miller (MMM) medium. In het centrifugatieonderzoek werden de cellen gedurende 60 minuten bij 4000 rpm in een container van 6 x 1 liter van het hart gescheiden. Er werden monsters van de supernatant genomen om de terugwinning van toxoïden te detecteren. Bij diepe filtratie worden filters van 0,45 μm en 0,22 μm diep gebruikt die diatomeeënaarde en cellulose bevatten om de fermentatiebouillon te klaren. Het proces wordt uitgevoerd bij een temperatuur van 35 graden en 12 psi.

Een open TFF-flatpanelmodule wordt volgens de TFF-methode thermisch verbonden met een 0.22μm PVDF-membraan. Het op TFF gebaseerde klaringsproces werd uitgevoerd met een kruisstroomsnelheid van 2000 l/uur bij 23 graden, en het geklaarde filtraat werd geconcentreerd met een kruisstroomsnelheid van 1000 l/uur bij 25 graden met behulp van een conventioneel TFF-sandwich 30 kD PES-membraan. De geklaarde vleesvloeistof (ongeveer 6 liter) wordt in dit ultrafiltratieproces 10 keer geconcentreerd. Er werden tetanustoxoïdetests uitgevoerd op geconcentreerde retentiemonsters om de terugwinning van het product te beoordelen.

Diepe filtratie resulteerde in een productterugwinningspercentage van ongeveer 89%, waarbij TFF-eenheden resulteerden in een productterugwinningspercentage van meer dan 97%. Microfiltratie- en ultrafiltratieprocessen leveren consistent hogere productopbrengsten op dan het NFF-proces. Deze resultaten zijn gebaseerd op flocculatietesten (Lf).

 

04Verduidelijking van polysacharidevaccins

4.1 Overweging van de verduidelijking van het polysacharidevaccin

Het productieproces van zowel ontkoppelde/vrije polysacharidevaccins als gekoppelde polysacharidevaccins begint met het kweken van de gastheerbacteriën in een fermentor. Aan het einde van de fermentatie kunnen bacteriën worden behandeld met reinigingsmiddelen zoals DOC (natriumdeoxycholaat), Triton®X-100 of andere geschikte reagentia om de bacteriën te vernietigen en de afgifte van polysachariden te bevorderen. Vanwege de grote batterijcapaciteit is rechtstreekse inzameling via NFF economisch niet haalbaar, omdat de doorvoer zeer laag kan zijn. Daarom is de ideale keuze om een ​​centrifuge te gebruiken om de celklonten te scheiden. Ook het TFF-microfiltratieprogramma kan worden gebruikt. Het celvrije centrum/penetrant dat het polysacharide van belang bevat, wordt verder geklaard door een NFF-diepfiltratiesysteem, gevolgd door biobattered-filtratie, en vervolgens voortgezet tot stroomafwaartse behandeling voor verdere zuivering.

 

4.2 Strategie voor het ophelderen van polysacharidenvaccins

4.2.1 Eerste verduidelijkingsprocedure

Centrifugeren is een van de meest gebruikelijke technieken voor het scheiden van cellen van fermentatievloeistoffen. Afhankelijk van de schaal kan er gekozen worden voor continu centrifugeren of batch centrifugeren. Het is belangrijk op te merken dat een goede optimalisatie van de centrifugatieomstandigheden en hun werking essentieel is voor een succesvolle stroomafwaartse zuivering. Bij het selecteren van een specifiek TFF-membraan en poriegrootte is het belangrijk om rekening te houden met het molecuulgewicht van de polysachariden, die vaak groot en structureel complex zijn, met molecuulgewichten variërend van ongeveer 500 kDa tot meer dan 1000kDa. Vanwege de grote open poriegrootte kan het gebruik van 0,22 μm, 0,45 μm, 0,65 μm MF-membranen het succesvolle herstel van PS-moleculen in de osmotische oplossing garanderen.

 

4.2.2 Secundaire verduidelijkingsprocedure

De helderheid/troebelheid van de celvrije fermentatieoplossing die de secundaire klaringsstap bereikt, hangt af van de specifieke bacteriën, het splitsingstype, het individuele serumtype en de techniek die voor de primaire klaringsstap wordt gebruikt. De troebelheid van het centrum kan variëren van ongeveer 50 tot 150 NTU. Een positief geladen diepfilter met fractionele dichtheid, gemaakt van geïmpregneerd diatomiet met gevulde cellulosevezels, kan worden gebruikt om de troebelheid ervan te zuiveren en te verminderen tot < 5NTU.

De volumedoorvoer van dit diepfilter kan variëren van ongeveer 150 L/m3 tot 250 L/m3. Meestal wordt de geklaarde productoplossing gefilterd door een daaropvolgend 0,45 μm bioondersteund reductiekwaliteit of 0,22 μm gesteriliseerd membraan om alle resterende celdeeltjes, colloïden en potentiële micro-organismen te verwijderen.

 

4.3 Casestudy: Opheldering van het centrum van Streptococcus pneumoniae-fermentatiebouillon na centrifugeren

De cellen werden gescheiden door het toevoegen van {{0}},1% (v/v) type 8 Streptococcus pneumoniae fermentatiebouillon (20 L) door middel van continue centrifugatie. Het centrum van de collectie wordt gefilterd door twee afzonderlijke positief geladen en diatomeeënaarde-diepe filters die cellulosevezels bevatten. Het individuele diepe filterfiltraat werd vervolgens gefilterd door een bioloaded PVDF-membraan van 0,45 μm met reductiekwaliteit. Alle filtratietests werden uitgevoerd in constante stroommodus met peristaltische pompen. Filtratietesten met behulp van een geladen diep filter en Streptococcus pneumoniae serotype 8 fermentatiebouillon resulteerden in een daling van de troebelheid van ongeveer 120 NTU naar 3 NTU. De tests zijn uitgevoerd met een debiet van 140.150 l/m2/uur en een eindpuntdrukverschil van 20-25 psi, met een volumedoorvoer van ongeveer 180-200 l/m2.

Soortgelijke filtratietests werden uitgevoerd op de fermentatiebouillon van Streptococcus pneumoniae serotype 19A. De gecentrifugeerde 19A-vloeistof wordt geklaard door een geladen diepfilter, waardoor de troebelheid wordt verminderd van ongeveer 40 NTU naar 3 NTU. De tests werden uitgevoerd met een constante stroomsnelheid van ongeveer 140-160 L/m2/uur, en een volumetrische doorvoer van 200-230L/m2 werd bereikt bij een eindpuntdruk van ongeveer 15 psid. HLPC-analyse van productmonsters verzameld tijdens filtratie-evaluatietests liet geen significant opbrengstverlies zien voor diepe filtratie of 0.45 μm (of 0,22 μm) membranen.

 

05 Conclusie

De ontwikkeling van klaringsprocessen vereist de integratie van verschillende eenheidsprocessen zoals centrifugatie, TFF-MF, diepe filtratie en aseptische filtratie. De optimalisatie van het verduidelijkingsproces vereist inzicht in de manier waarop verschillende eenheidsoperaties elkaar beïnvloeden. De uitdaging is om technologieën en hulpmiddelen (apparatuur en armaturen) te selecteren die voldoen aan de steeds complexere eisen van procesvloeistoffen die worden geproduceerd door de efficiëntere bioreactoren van vandaag. De toename van de stroomopwaartse productiviteit (virale titer, celdichtheid, enz.), celafval en cellyseproducten vergroot de moeilijkheidsgraad van het klaringsproces en verwart de keuze van scheidings- en filtratieapparatuur.

Bij de keuze van de processchaal moet rekening worden gehouden met het ontwerp, het gebruiksgemak en de netheid van de apparatuur. Dit zorgt voor een efficiënte conversie en veiligheid voor de operator bij het omgaan met afgedankte filters. Om het klaringsproces te ontwikkelen is een sterke integratie van de klaringsstappen belangrijk om ervoor te zorgen dat de verwerking van de stroomopwaartse oogst kosteneffectief is. Er is een reeks filtratie-eenheden beschikbaar om laboratoriumtests, pilotproductie en volledige verwerking te vergemakkelijken. Door een goed ontworpen werkplan voor opschaling te implementeren dat meerdere verduidelijkingsopties evalueert, kan men vol vertrouwen zuiveringsfilters selecteren en op maat maken om de activiteiten van de stroomafwaartse eenheden te beschermen en tegelijkertijd de bedrijfskosten te verlagen.

De verduidelijking van vaccins brengt verschillende uitdagingen met zich mee. Doorgaans moet het filtratieproces worden afgestemd op het productiesysteem, het inactiverings- of lysemiddel en de antigeenpresentatie, en niet noodzakelijkerwijs op vaccins. Traditionele vaccinprocessen maken doorgaans gebruik van centrifugatie om het vaccin in eerste instantie te klaren. Moderne vaccins met meerdere technologieplatforms en kleinere verwerkingsvolumes maken vaccins geschikter voor opheldering door membraangebaseerde technologieën. Nieuw ontwikkelde vaccins die gebruik maken van moderne cellijnen en expressiesystemen en die gebruik maken van beter gedefinieerde celcultuuromstandigheden maken veel vaccinprocessen gunstiger voor filtratie.

 

De heterogeniteit in de antigene component of het ‘doelantigeen’ van vaccinproducten vergroot echter de complexiteit van de filtratieklaring. Antigenen variëren in grootte, oppervlaktechemie en lading. Deze kenmerken beïnvloeden de opbrengst en terugwinning van antigenen. Vaccins bieden unieke uitdagingen voor opheldering, voornamelijk vanwege de grootte van hun macromoleculen. Dit, gecombineerd met capaciteitsproblemen rond verduidelijking, vergroot de behoefte aan begeleiding bij procesontwikkelingsstrategieën.

De omvang en schaal van een operatie op commerciële schaal voor de productie van vaccins heeft een aanzienlijke impact op de keuze van de klaringstechnologie. Omdat het zich stroomopwaarts van het proces bevindt, is een goede zuiveringsoptimalisatie van cruciaal belang voor het succes van stroomafwaartse unit-operaties, waarbij de opbrengst, het herstel en de robuustheid van het proces worden gemaximaliseerd. Hoewel centrifugatie een haalbare technische optie blijft voor primaire klaring, winnen open-channel microfiltratie-eenheden (TFF) voor primaire klaring en fijne diepe filters of membraanfilters voor secundaire klaring steeds meer acceptatie in de vaccinindustrie. Deze verandering wordt gedreven door de behoefte aan snellere verwerking, snelle procesontwikkeling, draagbare processen en implementaties voor eenmalig gebruik. NFF biedt een economisch proces dat geschikt is voor kleine tot grootschalige opties voor eenmalig gebruik. Als gevolg van veranderende regelgevingsbehoeften bevordert de beschikbaarheid van pre-aseptische apparaten of modules voor gammastraling die zijn ontworpen voor autoclaveren een snellere aanpassing van op NFF of TFF gebaseerde technologieën.

Veel klassieke vaccinprocessen brengen de evolutie van operaties van klaringseenheden met zich mee, grotendeels als gevolg van wettelijke beperkingen en de daarmee gepaard gaande hoge kosten van revalidatie en herindiening of klinische proeven. Het platformproces dat gebruik maakt van het op filtratie gebaseerde klaringsschema is met veel succes op grote schaal gebruikt in verschillende biologische agentia. De voorbeelden en cases die in dit document worden geschetst, laten zien dat vaccinfabrikanten het potentieel hebben om dit niveau van stabiliteit, economische levensvatbaarheid en bruikbaarheid voor eenmalig gebruik te bereiken door de sjabloonbenadering te volgen.

Andere voordelen van filtratie ten opzichte van centrifugeren zijn afschuifgevoelige virussen of virussen die de neiging hebben zich op te hopen op het luchtgrensvlak. Naarmate fabrikanten van apparaten nieuwe producten op de markt brengen, zullen vaccinfabrikanten steeds beter toegerust zijn voor het ophelderingsproces.

 

Als eerste bedrijf in het lokalisatiecircuit heeft Guidling Technology voldoende relevante ervaring opgebouwd op het gebied van de opheldering van vaccins. Guidling Technology is een ontwikkelings- en productiebedrijf dat zich richt op biofarmaceutische en celcultuur, zuivering en scheiding. De producten worden veel gebruikt in de biogeneeskunde, diagnose, industriële vloeistoffiltratie, detectie, klaring, zuivering en concentratieprocessen; Guidling heeft met succes ultrafiltratiecentrifugebuis, ultrafiltratie/microfiltratiemembraancassette, virusverwijderingsfilter, tangentiële stroomfilterapparaat, diepe membraanstapel, enz. ontwikkeld, die volledig voldoen aan de toepassingsscenario's van biofarmaceutische en celcultuur.

Onze membranen en membraanfilters worden veel toegepast bij het concentreren, extraheren en scheiden van voorfiltratie, microfiltratie, ultrafiltratie en nanofiltratie. Ons brede assortiment productlijnen, van kleine laboratoriumfiltratie voor eenmalig gebruik tot productiefiltratiesystemen, steriliteitstesten, fermentatie, celcultuur en meer, kan voldoen aan de behoeften van testen en productie.