Onderzoek naar het vermogen om virussen weg te vangen van het stroomafwaartse proces van monoklonale antilichamen

Biotechnologieproducten die zijn afgeleid van cellijnen kunnen een risico lopen op virusbesmetting. De omvang hangt af van een aantal factoren, waaronder de herkomst van het preparaat, de gebruikte grondstoffen, het productiesysteem, zuiveringsreagentia en hulpstoffen. Het bestuderen van de verwijdering of inactivatie van virussen tijdens het productieproces is een belangrijke stap in het verminderen van de kans op iatrogene overdracht van pathogene virussen en daarmee het verminderen van het risico, wat essentieel is voor de veiligheid van producten. Voordat biologische producten op de markt kunnen worden gebracht en op de markt kunnen worden gebracht, moet worden aangetoond dat het productieproces ervan bekende en veronderstelde virussen kan verwijderen.

 

01 Veiligheidsbeoordeling van monoklonaal antilichaamproduct

Het onderzoek naar het virusverwijderingsvermogen gebeurt doorgaans door het bekende titerindicatorvirus aan het tussenproduct toe te voegen in verschillende productiefasen, vervolgens de resterende virustiter te bepalen in het monster dat met een specifiek proces is behandeld, en ten slotte de logreductiewaarde (LRV) te evalueren. van de virustiter. Processtappen voor LRV Groter dan of gelijk aan 4log10 worden over het algemeen beschouwd als effectieve stappen voor het verwijderen van virussen. Het proces met LRV<41og10 can be considered as helpful to increase the total virus clearance in the production process. However, due to the limitations of virus verification, the process with LRV≤11og10 has little significance for virus removal, and its LRV value is not included in the total amount of the production process.

Wanneer u de methode van een gesimuleerd productieproces (gereduceerd proces) gebruikt, is het noodzakelijk om een ​​redelijk onderzoek naar virusverwijdering/inactivatie en een testplan op te stellen dat zoveel mogelijk verband houdt met het daadwerkelijke productieproces, met name de effectieve stappen in het productieproces. Het gesimuleerde proces moet strikt consistent zijn met het daadwerkelijke proces wat betreft testparameters en controleomstandigheden.

 

02 Duidt doorgaans op virussen en verificatieschema's

Veel voorkomende indicatorvirussen worden weergegeven in Tabel 1.

In de fase van de experimentele toepassing van nieuwe geneesmiddelen (IND) vereist een biotechproduct virale klaringsstudies voor ten minste twee modelvirussen, waarbij doorgaans één retrovirus (X-MuLV) en één parvovirus (MMV) worden geselecteerd. Tijdens de fase van de vergunningaanvraag voor biologische geneesmiddelen (BLA) worden onderzoeken naar virusverwijdering doorgaans uitgevoerd met behulp van 3-5 specifieke/niet-specifieke virussen en worden 3-5 processtappen geëvalueerd om aan te tonen dat het product een adequate veiligheidsfactor heeft ten opzichte van een perspectief op virusveiligheid. Vanwege verschillende richtlijnen in binnen- en buitenland zijn er enkele verschillen in de verificatiestappen voor het opruimen van virussen die voor aangiften worden gebruikt. De veelgebruikte verificatieschema's voor virusklaring in het mAb-productieproces worden weergegeven in Tabel 2.

 

03 Virusverwijderingsvermogen van downstream-processen

3.1 Het vermogen van downstream-processen om verschillende virussen te verwijderen

Vanaf 2009 zijn monoklonale antilichaamproducten ingediend bij de FDA voor IND en BLA, proteïne A-affiniteitschromatografie, lage pH, anionenuitwisselingschromatografie AEX (stroompenetratiemodus), kationenuitwisselingschromatografie CEX (bindings-elutiemodus) en validatie van virusklaring met uitzondering van virusfiltratie zijn de meest gebruikte indicatorvirusfamilies en het gemiddelde en bereik van hun klaringseffecten worden weergegeven in Figuur 1.

Voor retrovirussen, met uitzondering van CEX, dat een LRV heeft van ongeveer 3log10 (zoals weergegeven in het A-staafdiagram in Figuur 1), waren de andere processen robuust (LRV groter dan of gelijk aan 4log10). Herpesvirussen en retrovirussen hebben vergelijkbare klaringseffecten en LRV > 4log10 (zoals weergegeven in het B-staafdiagram in Figuur 1). Kleine virussen zonder envelop, zoals het parvovirus, zijn moeilijker effectief te verwijderen, zijn resistent tegen chemische behandelingen en worden niet gemakkelijk opgevangen door filters (weergegeven in het C-staafdiagram in Figuur 1). Alleen AEX- en kleine virusfilters waren effectief bij het verwijderen van parvoviridae (gemiddelde LRV> 4log10).

De in Figuur 1 getoonde processen zijn ProteinA, AEX (stroompenetratiemodus), CEX (concomitatie-elutiemodus), inactivatie bij lage pH ("onvolledige" versus "volledige" verwijdering) en devirusfiltratie met grote en kleine openingen.

 

3.2 Beïnvloedende factoren van stroomafwaartse processen op het vermogen om virussen te verwijderen

De verdeling van LRV-waarden voor elk proces wordt weergegeven in Figuur 2. De onderzoeken met 0 ~ 21og10 werden geclassificeerd als lage LRV-groep, en die met meer dan 6log10 werden geclassificeerd als hoge LRV-groep voor vergelijkende analyse.

 

3.2.1 ProteinA-affiniteitschromatografie

Er was geen significante correlatie tussen de LRV-waarde van het Proteïne A-proces en de balans/wasbuffer, het vulmiddel, de samenstelling van het eluens en de pH-waarde van de elutie. De gemeenschappelijke noemer van de lage LRV-groep is dat de grondstof behoorlijk complex is, en het kan zijn dat de complexe interactie van grondstof en vulmiddel het vermogen van de chromatografische kolom om virussen te verwijderen negatief beïnvloedt.

 

3.2.2 AEX (Flow Through-modus)

Strauss et al. toonde aan dat de pH en geleidbaarheid van AEX-monsters de LRV kunnen beïnvloeden. De statistische resultaten van Miesegaes et al. toonden echter aan dat, vergelijkbaar met ProteinA, de LRV van AEX (flowpenetratiemodus) geen significante correlatie had met verschillende buffers, vulstoffen, pH en geleidbaarheid, wat te wijten kan zijn aan de optimalisatie van pH en geleidbaarheid. in de procesomstandigheden van de gemelde zaak.

 

3.2.3 CEX (binding - elutiemodus)

Virusverwijdering via het CEX-proces is niet robuust genoeg. Er was geen significante correlatie tussen de LRV in de hoge LRV-groep en de buffer, het ervaringsniveau of enige chromatografische kolomeigenschappen, zoals kolomhoogte en harstype. De pH-waarden voor evenwicht/belasting en elutie die in het onderzoek met hoge LRV werden gebruikt, waren echter beide lager, namelijk 5,3±0.2; In de lage LRV-groep was de pH 6.0±0.2. Een andere factor is dat de zoutconcentratie in de buffer ook het LRV-waardeverschil kan veroorzaken. De buffer die werd gebruikt in het onderzoek met lage LRV had een hogere zoutconcentratie, met een gemiddelde concentratie van 290 ± 120 mM in de laad-/balanceringsoplossing en 340 ± 70 mM in het eluens, terwijl de NaCl-concentraties in het onderzoek met hoge LRV 58 waren. respectievelijk ±27 mM en 183±31 mM.

 

3.2.4 Inactivatie bij lage pH

Bij het lage pH-proces is de pH een belangrijke procesparameter, en een pH van 3,8 is voldoende om het retrovirus geleidelijk te inactiveren. De lage LRV-groep had een pH van 3,9, terwijl het hoge LRV-onderzoek een pH van 3,4 had.

 

3.2.5 Virusfiltering verwijderen

Voor zowel kleine als grote diafragmafilters was de LRV-waarde van MuLV-verwijdering niet minder dan 2log10, en slechts 1% van de onderzoeken lag onder de 3log10 (weergegeven in de h- en i-kolommen in figuur 2). De totale klaring van retrovirussen door virusfilters met grote opening was lager dan die door virusfilters met kleine opening (zoals weergegeven in het C-staafdiagram in Figuur 1). De belangrijkste reden die het resultaat van de verwijdering van het parvovirus beïnvloedt, zijn de verschillende filtertypen. Over het algemeen kan antivirusfiltering virussen op betrouwbare wijze verwijderen.

De processen zijn Proteïne A(a), AEX-penetratiemodus (b), CEX-binding - elutiemodus (c), AEX-binding Ⅰ elutiemodus (d), Inactivatie bij lage pH ("onvolledige" en "volledige" klaring) (e ~ g), en grote poriegrootte (h) en kleine poriegrootte (i ~ j) devirusfiltratie (waarbij a ~ i: Retrovirus; j: Parvovirus).

 

04 Innovaties en uitdagingen bij de beoordeling van virusbeveiliging

De voortdurende ontwikkeling en innovatie op het gebied van downstream biofarmaceutische processen zullen onvermijdelijk leiden tot innovaties op het gebied van de beoordeling van de virusklaring. Vooruitgang in upstream- en downstream-processen, zoals continue stroombioprocessen, heeft het noodzakelijk gemaakt om effectieve en robuuste virusverwijderingsprocessen te beoordelen en op te zetten. Tijdens een continue stroom wordt nog steeds verwacht dat stappen zoals virusinactivatie en virusfiltering in batchmodus worden uitgevoerd. Hoewel het virusverwijderingsvermogen van chromatografische processen in continue stroommodus niet substantieel mag verschillen van dat van batchverwerking, moet het door gegevens worden ondersteund.

 

05 Vooruitzichten

Vanuit een virologisch veiligheidsperspectief kan de uitstekende veiligheid van de biofarmaceutische industrie grotendeels worden toegeschreven aan de strikte naleving door de industrie van drie sleutelstrategieën voor virale veiligheid: het adequaat inkopen en testen van materiaal- en celbankbronnen, het documenteren van beoordelingen van virale klaring (virusvalidatiestudies), en virale testen tijdens het proces. De kenmerken van biologische geneesmiddelen geproduceerd door nieuwe celsubstraten kunnen veranderen met verschillende risico's, en goede risicobeheerstrategieën zijn vereist om de veiligheid van biologische geneesmiddelen te garanderen. Guidling Technology beschikt over een ervaren professioneel technisch team dat het filtratieproces bestrijkt, van kleine proeven, pilotproeven tot grootschalige productie. Onze membraan- en membraanfilters worden veel gebruikt in voorfiltratie, microfiltratie, ultrafiltratie, nanofiltratieconcentratie, extractie en scheiding; Onze vele productlijnen, van kleine laboratoriumfiltratie voor eenmalig gebruik tot productiegerichte filtratiesystemen, steriliteitstesten, fermentatie, celcultuur en meer, zorgen voor een verhoogde productiviteit.

Jiuling om de kwaliteit van de producten als eerste indicator te garanderen, bij het nastreven van "kosten verlagen, efficiëntie verhogen" op weg om te verkennen, en ik kijk ernaar uit om in de toekomst met u samen te werken om de uitdagingen van de industrie het hoofd te bieden en te streven naar betere ontwikkeling.